1 / 29

Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays)

Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays). Ivo Nentwich IMTRA, Ahus. Immunometriske analyser (immunoassays). Subgruppe av immunologiske teknikker Spesifikk binding mellom antigen-spesifikt antistoff som er markert (“labelling”)

hagen
Download Presentation

Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Immunologiske teknikkerImmunometriske analyser (immunoassays) Ivo NentwichIMTRA, Ahus

  2. Immunometriske analyser(immunoassays) • Subgruppe av immunologiske teknikker • Spesifikk binding mellom antigen-spesifikt antistoff som er markert (“labelling”) • Reaksjonen visualiseres vha målbart signal (enzym, radioaktiv, fluorescens, chemiluminiscens..) • Signalet måles med tilsvarende deteksjonssystem

  3. Immunometriske analyser(immunoassays) • EIA - ELISA og modifikasjoner (Elia, ImmunoCap) • Dot Blot, Line-blot, Western blot, multiplex immunoassays • ELISPOT • Radiometriske metoder (RIA, radiobinding assay, RAST) • Immunfluorescens

  4. Immunometriske metoder • Generelt skjema for immunoanalyser

  5. Immunoanalyse karakteristikker

  6. Markeringssystemer • Enzymer (HRP pepperrot peroxidase, AP…) • Enzymer med fluorescent deteksjon (FEIA) • Enzymer med kjemiluminiscens deteksjon (Immulite) • Radioaktive isotoper (I125, S35, P32…) • Fluorokromer – FITC, PE…. • Gull, sølv..

  7. Immunometriske teknikkerfor påvisning av antistoff (indirekt metode)

  8. Påvisning av antigen(sandwich ELISA) • Antistoff bundet på fast fase

  9. Påvisning av antigen(sandwich ELISA)

  10. ELISA - plate

  11. ELISA, RIA – litt om histori • RIA (Yalow, Berson 1960) • Helsefarlig stråling • Utvikle kobling mellom antistoff og enzym (Avrameas, Pierce) • Utvikling av immunosorbent (Wide, Porath 1966) • 1971 Perlmann, Engvall – SE, Schuurs – NL publiserte den nye EIA/ELISA

  12. Phadia Elia • Anti-IgG/A/M – enzymmarkert (beta-galaktosidase) • Methylumberliferyl-B-D-galaktosid • Stopping av enzymreaksjon • Fluorescens-måling ved 445 nm

  13. Dot blot • Direkt påføring av antigen på nitrocellulose membran • Preinkubasjon (blokkering) • Inkubasjon med antistoff mot antigen vi leter etter (antigenpåvisning) • Inkubasjon med pasientens serum • Markert antistoff (enzym, radioaktiv…)

  14. Dot blot • Resultat • Deteksjon – enzym, radioaktiv (film), kjemiluminiscens (film) 1 2 3 4 1 2 3 4

  15. Line-blot • Påvisning av antistoff • Kjent renset antigen (oftest rekombinant) • Inkubasjon med pas. serum • Deteksjon – oftest enzym – kvantitativt, semikvanitativt, densitometri • Radioaktiv, ECL (kjemiluminiscens)

  16. Western blot - immunoblot • Deteksjon av antistoff mot ukjente antigen/allergen • SDS-PAGE med halv-tørr (semi-dry) blotting teknikk

  17. Western blot - immunoblot • Antigenene delt etter molekylvekt • Inkubasjon med serum, vasking, antistoff • Deteksjon kvalitativt, semikvantitativt eller kvantitativt (densitometri)

  18. ELISPOT • Produksjon av substanser på single-cell-level • Mest til påvisning av cytokiner, antistoff

  19. ELISPOT – modifikasjoner med fluorokromer

  20. ELISPOT - resultat Typical Areas of ELISpot assays • Characterization oh the TH1/TH2 response • Vaccine Development • Infectious diseases, i.e. HCV • Therapy monitoring • Epitope mapping • Autoimmunity • Transplantation

  21. Radioimmunoassay RIA • Klassisk metode • Kompetitiv likvidfase analyse • separasjontrinn

  22. Radioimmunosorbent analyser Kompetitiv binding radioimmunoanalyse Non-kompetitiv immunoradiometrisk analyse Non-competitive (two-site) immunoradiometric assay (IRMA) Likner sandwich ELISA

  23. RAST – klassisk etterfølger av RIA • 1974 Pharmacia Sverige • IgE antistoff mot allergener • 1989 erstattet av ImmunoCap(CAP RAST, CAP Feia) • Modifikasjon – paper radioimmunosorbent test PRIST – ikke routinemessig i bruk

  24. Phadia ImmunoCap • FEIA (fluoroenzymoimmunoassay) • Spesifikk IgE testing – type I allergi

  25. ImunoCap ISAC mikrochip • Miniaturisert immunoassay platform muliggjør multianalyse av spesifikk antistoff IgE, IgG, IgG4 mot flere allergenkomponenter • 20 μl of serum / plasma • Rensede eller rekombinante allergenkomponenter på fast fase (biochip) • Inkubasjon, vasking • Fluorokrom-markert anti-humant IgE antistoff • biochip scanner, software nødvendig • semikvantitativ test: ISAC Standardized Units (ISU) • Dyrt, semikvantitativt, vanskelig å interpretere, ikke fleksibelt – fast kombinasjon av 113 allergener

  26. Analyser av multiple antistoff– multiplex immunoassay • Polystyren mikrokuler impregnert med varierende proporsjoner av to ulike fluorokromer • Familie av mikrokuler med unik fluorescens markering • Koblet med antigen • Inkubering, vask, markert antistoff • Deteksjon – simultant hver mikrokul og bundet markert antistoff • Brukes bl.a. til påvisning av antinukleære antistoff

  27. Immunometriske metoder

  28. Immufluorescens • Direkte IF DIF (påvisning av bundet antigen i veven) • Indirekte immunfluorescens IIF (påvsning av antistoff) • Mikroskopisk preparat av celler/vev.. • Inkubering med serum • Vasking, anti-IgG-FITC • Avlesing vha fluorescensmikroskop, titer rapporteres • Eksempel: • ANCA/ANA – multiblokk • Indirect fluorescent antiboty test (IFAT)

  29. Takk fra Ahus

More Related