Pesquisas em genoma funcional

1. Pesquisas em genoma funcional “Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas Quando? Década de 90 Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante - Barateamento do preço dos sequenciamento Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas Fatos: - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila completamente sequenciado - Genoma do camundongo completamente sequenciado - Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies

2. Consequências atuais - Grande quantidade de informação disponível - Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010 - Análise científica mais holística Consequências futuras: - Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas - Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema

3. Estudo expressão gênica em larga escala Descoberta de genes Seleção de mutantes Data mining Clonagem e sequênciamento Posição no mapa gen. ou físico; Baseado na inserção de sequência alvo Estudos das interações Testes funcionais Estudos genéticos Estudos de expressão in situ Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas EMS, radiação, T-DNA, transposons cDNA macro/microarrays; genechips Criação e análise de um banco de dados Sistema duplo-hibrido de leveduras Complementação leved. Phage display Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação Mutante em Arabidopsis Superexpressão Alelismo Aditividade Antisenso. Epistasia Fusão proteína com GFP Supressão por RNAi Supressão Expressão GFP ou luciferina com o promotor Construção de modelos de controle dos processos envolvidos Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultânea da expressão de vários genes

5. Transcriptoma: Análise dos níveis de RNA de varios genes simultaneamente Um genoma possui varios transcriptomas …varios transcriptomas temporais Ex: tempo apos sujeicao a um estresse Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento …varios transcriptomas espaciais Ex: transcriptoma celular-especifico Ex: transcriptoma tecido-especifico Ex: transcriptoma orgao-especifico

6. Etapas para a realizacao de um transcriptoma

7. 1) Filme Macroarray.mov 2) Filme oligochip.mov

9. 1a Etapa de um transcriptoma Isolamento de DNA do banco de cDNA Preparacao do Micro/Macroarranjo (Micro/macroarray)

10. 2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda Duração do protocolo: 5 horas

11. 2a Etapa de um transcriptoma: hibridação

12. 3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo tolerante Sonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresse Sonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse a Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência; fluorescênica b d Gene com reduzida expressão na presença do estresse Gene expressão acentuada na presença do estresse • Nível de expressão na presença do estresse: • + x% • + y% (y>x) • -z% Genes sem alteração na expressão

13. 3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem 1 5 1 2 3 4

14. Exemplo de data mining 5247 genes alvos sondas: 5 pontos temporais 6626 genes alvos 19 sondas Dinamica da expressao Agrupamento 8300 genes alvos 197 genes orgão-específicos Sondas: Caracterizacao gene/rota raiz=64 folha=94 flor=36 influorescencia=3 folha =6 raizes=4 flores=2 Siliqua=3 Influorescencia=2 Plantula=2 Matriz da expressão nos orgaos Identificação de sequências regulatórias 347 genesconstitutivos Agrupamento de expressão global Analise da abundância do transcrito Descoberta da função de genes desconhecidos Análise da homologia das sequências Análise da biologia molecular do gene: co-regulação? Confirmação pela genética reversa Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,221-241

15. Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses ambientais em Arabidopsis Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses

16. Análise de Grupos: 2 genótipos Genótipo sensível ao estresse salino: IR29 (direita) Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)

17. Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular

18. Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator transcripcional DREB1A Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator transcripcional DREB1A

19. Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot

20. Classes de genes afetadas pelo estresse salino

21. Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno

22. Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes Vantagens: - estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada

23. 8100 genes (Genechip) Manitol (200 mM) 4oC Controle Meio Fresco 741 genes 2086 genes 1008 genes 1123 genes 58% 53% NaCl (100 mM) 42% 46% Genes > 2x = Total 2678 Genes 375 Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress

24. 375 120

25. 120 375 87 59

26. Estresse por frio: sobreposição 3-27h Estresse salino: sobreposição 3-27 h na raiz 22 5

28. Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h) 200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato) Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estresses Mais induzido gene ELIP: liga a chl a Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas 3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state” Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse: ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇ Pistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz • Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1: • Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores • Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.

30. Transcriptoma e proteoma Identificacao de genes e proteinas associados a tolerancia Caracteriz. do fenotipo QTL Selecao assistida por marcadores Locus genico candid. Segregacao alelica Mapeamento de populacoes Melhoramento molecular Identificacao de genes/marcadores ligados a tolerancia Locus quant. transcrito Transcriptoma Locus quant. proteina Proteoma Transformacao Mapa genetico Caracteriz. do genotipo Identificacao de genotipos tolerantes e susceptiveis

31. Em colaboracao: Instituto de Quimica USP Embrapa-Cenargem Unicamp UNESP-Araraquara Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma Realizado na UFV

32. Melhores resultados Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes