Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos

1. Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos em identificar esses genes • 15 mil a 30 mil diferentes RNAs • População de RNA em uma célula >100 000 moléculas de RNA • Classe RNA abundantes: 1% dos genes = 50% da pop. de RNAs • Classe de RNA raros: metade dos genes = 1% pop. de RNAs

2. Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos • Limitações microarrays: • Genes pouco expressos não são detectados • Difícil separação da contribuição de diferentes isoformas de um mesmo gene Outros métodos • Subtração de bibliotecas • PCR supressivo • mRNA fingerprint • cDNA-AFLP • CAP Trapper

3. Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos Subtração de bibliotecas de cDNA sistema utilizando biotina, streptavidina e partículas magnéticas Tester: biblioteca de cDNA aonde estão os genes que quero fisgar meu gene (gene induzido peloetileno:: tratamento com etileno) Driver: biblioteca de cDNA aonde não estão os genes que quero fisgar meu gene (genes não induzidos pelo etileno:: tratamento sem etileno)

5. Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos PCR supressivo

6. PCR supressivo

7. PCR supressivo Sequência não forma est. pan em moléculas maiores, só em menores

8. SUPRESSION PCR

9. Differential RNA display Gene 1 AAAAAAAA AAAAAAAA AAAAAAAA Gene 2 GCUAAAGCGA GCUAAAGCGA GCUAAAGCGA TTTTTT TTTTTT TTTTTT Primer decâmero randômico Primer decâmero randômico Primer decâmero randômico Primer OligodT Primer OligodT Primer OligodT Gene 3 TTTTTT GCUAAAGCGA 2 dias TTTTTT GCUAAAGCGA TTTTTT GCUAAAGCGA Condição 1 Condição 2 Gel de poliacrilamida e uréia (sequenciamento) Gene mais expresso na condição 1 Gene mais expresso na condição 2 Gene somente expresso na condição 2 Reação de PCR com baixa temperatura de anelamento, com nucleotídeos marcados radioativamente

10. Criticismos • Pouca capacidade para detectar RNA raramente expressos • Banda do gel: mistura de cDNAs: 50-75% bandas = falsos positivos • Artefatos: primers curtos e baixa temp. anelamento: amplificação inespecífica • Limitada quantitividade: competição pelos primers por transcritos de diferentes abundâncias • Primers curtos: semi-pareamento em outras regiões do mesmo gene:dif. Clones positivos podem ser o mesmo gene • Fragmentos pequenos (150-400 bp) contendo principalmente região 3’ UTR: difícil identific. • Modificações do método original • Primers mais longos com programa com ciclo alterado • Combinação com subtração • Arbitrary primed PCR (RAP-PCR): dois primes curtos: probl. Falsos positivos • Integração do protocolo para PCR de longa distância no Differential display (até 2Kb- LDD-PCR)

11. Genótipo: Columbia, • Usando primer EcoR I+AC e: • Mse I primer+AA (lanes 1 and 2); • Mse I primer+AAA (lanes 3 and 4). • EcoR I+CC and Mse I+AAA). • Ecotipos de A.thaliana: • linhas 1 and 2.Columbia; • linhas 3 and 4. Landsberg. Introdução de um novo nucleotídeo Levou a amplificação de um outro subgrupo de cDNAs

14. Uso em larga escala do cDNA-AFLP • Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and M→G1 transition were sampled. • Exhaustive cDNA-AFLP: 360 AFLP primer combinationsÇ 18,000 AFLP tags • About 10% exhibited a modulated cell cycle profileÇ 1150 AFLP tags • Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1→S transition phase using • Majority of these AFLP tags either match genes of unknown function or represent novel sequences.