Kapittel 20 CELLE-CELLE SIGNALER – HORMONOER OG RESEPTORER

1. Kapittel 20CELLE-CELLE SIGNALER – HORMONOER OG RESEPTORER • Oversikt over ekstracellulær signalisering (20.1) - Signalmolekyler og signaltransduksjon • Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer (20.2) • G protein-koblet reseptorer og deres effektorer (20.3) • Reseptor Tyrosin Kinaser og Ras (20.4) • Sekundære budbringere (20.6)

2. INTRODUKSJON • Alle multicellulære organismer er avhengig av intercellulær kommunikasjon for å koordinerer organismens ulike kroppsfunksjoner (feks vekst, differensiering og metabolisme) • Cellene kommuniserer med hverandre ved direkte celle-celle kontakt eller over lengre avstander via spesifikke ekstracellulære signalmolekyler, primære budbringere. • Signalmolekylet (hormon, feromon, neurotransmitter) er en ligandsom spesifikt bindes til en reseptor på mottakercellen, i cellens cytosol eller nukleus, og utløser en spesifikk cellulær respons. • Reseptorene kan være forbundet til intracellulære signalmolekyler kalt sekundær budbringere (eks cAMP). De formidler informasjon fra de primære budbringerne på cellens utside til intracellulære prosesser. • Signaltransduksjon– en prosess hvor ekstracellulære signaler omdannes til en cellulær respons.

3. Oversikt over ekstracellulær signaliseringkap 20-1 • Signalisering via ekstracellulære molekyler klassifiseres i tre typer: • endokrine – hormoner sekretert fra endokrine kjertler og fraktes til målcellen via blodbanen (fig. 20-1a) • parakrine – signalmolekyler (eks neurotransmittere) som frigjøres fra en celle virker kun på nærliggende celler (fig. 20-1b).

4. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1 3) autokrine – cellen er selv målcellen for de signalmolekyler den skiller ut (fig. 20-1c). Feks overproduksjon av veksthormoner i kreftceller. • I tillegg kan proteiner bundet til plasmamembranen av en celle kommunisere direkte med reseptorer på nabocellen (fig. 20-1d).

5. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Hormoner klassifiseres etter deres løselighet og lokalisering av reseptor. Tre hovedgrupper: 1) Fettløselige hormoner som diffunderer gjennom cellemembranen og bindes til intracellulære reseptorer i cytosol eller nukleus (fig. 20-2a). Hormon-reseptor komplekset kan fungere som transkripsjonsfaktor ved å binde til DNA og regulere transkripsjon av spesifikke gener. - Steroider (cortison, progesteron, testosteron) og retinoider virker på vekst og differensiering. - Thyroxin øker bla uttrykk av cytosoliske enzymer i sukker, fettsyre og proteinkatabolismen.

6. 2) Vannløselige hormoner kan ikke diffundere gjennom celle- membranene, men bindes til reseptorer på overflaten.Mange vannløselige hormoner modifiserer en enzymaktivitet som allerede er tilstede i målcellen, men kun for en kort periode. Feks cAMP, Ca2+, membranpotensial. a) peptidhormoner (insulin, vekstfaktorer, glucagon) b) små ladede molekyler (ephinephrine, histamin) som fungerer både som hormoner og neurotransmittere 3) Fettløselige hormoner som bindes til overflatereseptorer kalt prostaglandiner. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Hormoner klassifiseres etter deres løselighet og lokalisering av reseptor

7. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Celle-overflate reseptorer • Overflate reseptorer kan deles inn i 4 klasser etter hvordan informasjonsoverføringen skjer fra reseptor: • G-koblet protein reseptor. Binding av ligand til reseptor aktiverer G-protein  aktiverer/inhiberer effektorenzymer  aktiverer sekundære budbringere (fig. 20-3a).

8. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Celle-overflate reseptorer • Ione-kanal reseptor, hvor binding av ligand medfører endring av konformasjonen  åpning av ionekanal  endring av elektrisk potensial over cellemembranen (fig. 20-b). • Tyrosin kinase-koblet reseptor, mangler katalytisk aktivitet, men binding av ligand medfører dimerisering av reseptor interaksjon og aktivering av inaktive cytosoliske tyrosin kinaser (fig 20-3c)

9. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Celle-overflate reseptorer • Reseptor med ligand-trigget enzymaktivitet i det cytosoliske domene. F.eks vil binding av ligand medføre omdanning av GTP til cGMP (sek. budbringer). Reseptorer for veksthormoner og insulin har protein kinase aktivitet, som autofosforylerer det intracellulære reseptordomene og fosforylerer andre proteiner.

10. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Andre proteiner som deltar i signaltransduksjon • Tre hovedklasser intracellulære signal proteiner: • GTPase - av og på mekanisme. Aktiveres ved binding med GTP og inaktiveres med GDP. Forekommer som G-protein (trimer) og Ras (monomer), og regulerer aktivitet til spesifikke effektor proteiner (fig. 20-5a) • Protein Kinase - del av reseptor, assosiert med plasmamembran eller fritt i cytosol. Aktivt kinase fosforylerer serin, threonin og tyrosin i målproteiner. Kombinert med fosfatase (defosforylerer proteiner), reguleres proteinets aktive/inaktive tilstand (fig. 20-5b)

11. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Andre proteiner som deltar i signaltransduksjon • Adapter protein - inneholder flere protein-bindende seter som promoterer dannelsen av multiprotein signal komplekser. Har hverken katalytisk aktivitet eller aktiverer effektor proteiner (fig. 20-5c).

12. Oversikt over ekstracellulær signalisering kap 20-1Signalspor for GPCR og RTK • Binding av ligand til G-Koblet Protein Reseptor (GPCR) og Tyrosin-Kinase Reseptor (RTK) aktiverer to ulike signalspor. Begge kan utløse samme cellulære respons (fig. 20-6) • Syntese, frigjøring og degradering av ekstracellulære signaler, samt de ulike signalsporene, er nøye kontrollert ved positiv/negativ feedback for å opprettholde homeostasis i cellen.

13. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer • Hormonreseptorer binder sine ligander med høy spesifisitet og affinitet. • Ionebindinger, van der Waals-krefter og hydrofobe interaksjoner. • Binding mellom reseptor og ligand kan beskrives med en enkel, reversibel reaksjon: R + H -> RH • KD = [R][H] / [RH]omskrevet: [RH] / RT = 1 / (1 + KD) / [H]der RT er summen av fri og bundne reseptorer, [R] + [RH].

14. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer

15. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer • Deteksjon: Binding assays, evne til å binde radioaktivt merkede hormoner. • Typisk: 10.000-20.000 reseptorer for et gitt hormon i en celle. • Total binding = spesifikk binding + ikke-spesifikk binding. • Beregning av totalt antall bindingsseter og KD-verdi. For insulinreseptor på hepatom-celle: ca. 30.000 bindingsseterKD ~ 0,12 g/ml • Blod inneholder ~10 mg/ml total-protein, dermed kan reseptoren detektere insulin i nærvær av 100.000-ganger overskudd av andre proteiner

16. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer • Generelt vil KD for en hormonreseptor ligge nær ligandkonsentrasjonen i blodet. • Endringer i hormonkonsentrasjonen vil reflekteres gjennom en proporsjonal endring i fraksjonen av bundne reseptorer: [H]normal = 10-9 MKD = 10-7 Mgir [RH]/RT = 1%[H]unormal = 10-8 Mgir [RH]/RT = 10% • Ofte er cellulær respons proporsjonal med mengden bundet reseptor, slik at også responsen øker ti ganger.

17. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer • Isolering: Affinitets-relaterte metoder. • Metning av bindingsseter med radioaktivt merket hormon, kovalent kryssbinding av hormon-reseptor-kompleks med reagens som reagerer med fri aminogrupper. Komplekset brytes ikke av detergenter, etc. • Affinitetskromatografi kan brukes når den aktuelle reseptoren opprettholder bindingsevnen i løsning. • Polysterene-kuler bundet til ligand. • Løsning av total-protein. • Vasking. • Eluering.

18. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer • Isolasjon gjennom kloning. Særlig nyttig når antallet resptorer i cellemembranen er for lite til å kunne isoleres ved tidligere nevnte metoder. • Plasmid-cDNA bibliotek. • cDNA overføres til celler som normalt ikke uttrykker reseptoren. Celler som har tatt opp ”riktig” cDNA detekteres gjennom evne til å binde radioaktivt eller fluorescens-merket ligand. • Sekvensering. • Reseptoren kan masseproduseres i et system med høyt uttrykk slik at tilstrekkelig protein kan isoleres for karakterisering.

19. 20.2 Identifisering og rensing av celle-overflate reseptorer

21. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorerBinding av epinephrine til adrenergisk reseptor induserer vevs-spesifikke responser • Epinephrine binder seg til to typer GPCR som er viktig i kroppens respons til stress,  og  reseptorer. • -adrenergiske reseptorer: finnes på overflate av, lever, fett, hjertemuskelceller og de glatte muskelcellene i tarmsystemet. • -adrenergiske reseptorer deles inn to, 1 og 2 som begge er koblet til G-protein (Gs) som aktiverer adenylat cyklase. • - adrenergiske reseptorer finnes i glatte muskelceller i blodårevegger i tarm hud og nyrer. • - adrenergiske reseptorer deles inn i 1 og 2. Disse stimulerer hver sitt G-protein, henholdsvis Gq og Gi. Gi inhiberer adenylat cyklase, mens Gq aktiverer phospholipase C. • 2 fører til nedsatt sirkulasjon til de perifere organene.

22. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorerReseptoraffinitet • GPCR har liknende 3D struktur. Likevel er forskjellene i aminosyre sekvensen store. 1 og 2 er kun 50% identiske. • Den spesifikke aminosyre sekvensen er avgjørende for hvilket ligand som bindes og hvilket G-protein reseptoren interakterer med.

23. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorer-adrenergiske reseptorer og adenylat cyklase • Gs består av 3 subenheter, ,,. • I fravær av hormon vil disse tre enheten være bundet sammen og til  enheten er det bundet GDP. Dette er et inaktivt kompleks. • Ved stimulering av hormon skjer det en konformasjons endring i reseptoren som fører til binding av Gs som igjen fører til at GTP erstatter GDP i Gs. • Gs komplekset, som dissosierer fra G komplekset, binder seg til og aktiverer adenylat cyklase. • Adenylat cyklase omdanner ATP til cAMP. • cAMP er den sekundære budbringer som påvirker flere metabolske responser i cella. • GTP bundet til Gs hydrolyseres raskt til GDP og i fravær av ny stimulering fra hormon vil G assosieres med Gs og inaktivering av adenylat cyklase.

24. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorer Fig. 20-16 Aktivering av adenylat cyklase etter binding av hormon til Gs-protein koblet reseptor.

25. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorer Amplifisering av hormonsignal • En reseptor kan aktivere over 100 inaktive Gs molekyler. • Hvert Gs GTP-kompleks kan hver aktivere en adenylat cyklase. • Hver adenylat cyklase kan syntetisere cAMP så lenge Gs GTP-komplekset er bundet. • Et hormon kan derfor føre til syntese av flere hundre cAMP. Terminering av cellulær respons • For aktivering av adenylat cyklase trengs kontinuerlig tilstedeværelse av et hormon bundet til reseptoren. • Terminering av responsen skjer ved at affiniteten for binding av hormon til reseptoren synker. Dette skjer når Gs blir omdannet fra inaktiv til aktiv form. • GTP bundet til Gs hydrolyseres raskt til GDP og vil inaktivere adenylat cyklase.

26. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorer Figur 20.17. Koleratoksinet hindrer hydrolysering av GTP til GDP og vil derfor føre til at signalet ikke blir slått av. Høy cellulær konsentrasjon av cAMP.

27. Kap. 20.3 G-protein koblede reseptorer og deres effektorer Adenylat cyklase stimuleres og inhiberes av ulike reseptor-ligandkomplekser. • Et eksempel på dette er i leverceller der glukagon og epinephrine bindes til forskjellige GPCR. Begge aktiverer adenylat cyklase og fører til samme metabolske respons. • Hos noen celler f.eks. fettceller kan cAMP nivået i cella opp- og nedreguleres ved forskjellige hormoner. Epinephrin, glukagon og ACTH stimulerer adenylat cyklase, mens prostataglandin PGE1 og adenosin inhiberer. Figur 20.18. Stimulering av adenylat cyklase via Gs GTP-komplekset og inhibering via Gi. Disse binder seg til forskjellige seter på adenylat cyklasen noe som fører til de forskjellige responsene. G enheten er den samme i begge G-proteinene, mens G enhetene og reseptorene er forskjellige.

28. Kap. 20.4 Reseptor tyrosin kinase og Ras RTK

29. Kap. 20.4 Reseptor tyrosin kinase og Ras Ras • Ras er eit protein som høyrer til GTPase superfamilien(i likheit med G-protein). Denne familien består av GTP-bindande protein som skiftar mellom ein inaktiv tilstand bunde til GDP, og ein aktiv tilstand bunde til GTP. • Ras fungerer nedstrøms for RTK. I motsetning til G-protein, krever Ras-sykleringa assistanse av to andre protein, GEF og GAP. • GEF(Guanine nucleotid exchange factor) bind seg til RasGDP komplekset og dette fører til dissosiasjon av det bunde GDP. Fordi [GTP] i cella er mykje høgare enn [GDP] vil GTP binde seg spontant til ”tomme” Ras molekyl, og GEF vil dissosierast. (FIGUR 20-22) • GAP(GTPase-activating protein) er med i deaktivereringa av Ras ved at det bind seg til RasGTP og aksellererer GTPase aktiviteten.

30. Kap. 20.4 Reseptor tyrosin kinase og Ras Koblinga mellom RTK og Ras • RTK er indirekte kobla til Ras gjennom to protein, GRB2 og Sos (FIGUR 20-23) • Eit SH2 domene i GRB2 bind seg til ein spesifikk fosfotyrosin i den aktiverte reseptor tyrosin kinasen (RTK). GRB2 har også to SH3 domener som bind seg til og aktiverer Sos. Dette bringer Sos nær den membranbundne RasGDP, GDP blir frigjort, GTP bunde og Ras er aktivert. • GRB2 fungerer såleis som eit adapter protein og Sos fungerer som ein Guanine nucleotid exchange factor (GEF), som hjelper til med å omdanne inaktiv Ras til den aktive GTP bundne forma. (samanlikn med FIGUR 20-22)

31. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter • Cyklisk AMP (cAMP) syntetiseres av adenylat cyclase, et enzym som aktiveres av hormonbundede Gs bundne protein reseptorer. • cAMP og andre sekundære metabolitter aktiverer spesifikke protein kinaser; cAMP-avhengige protein kinaser (cAPK’er). • cAPK’er er tetramere forbindelser som består av to regulatoriske enheter (R-enheter) og to katalytiske enheter (C-enheter).

32. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter • Som tetramer er cAPK inaktiv. Ved binding av cAMP til de regulatoriske enhetene i cAPK dissosierer disse fra de katalytiske enhetene, som dermed aktiveres. • cAMP fester seg på to ulike steder i R-enhetene i cAPK; A-setet og B-setet. Binding av cAMP i B-setet endrer konformasjonen i A-setet slik at cAMP kan bindes her. Binding av cAMP i A-setet stimulerer dissosiering av R-enhetene fra C-enhetene, og dermed aktivering av protein kinasen. • De fleste cAPK’er inaktiveres av pseudosubstrat som opptar B-setet i R-enheten på protein kinasene.

33. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter cAMP’s rolle i glykogen metabolismen • cAMP deltar i mange ulike prosesser i levende organismer, blant annet i glykogen metabolismen. • Glykogen syntetiserer av glykogen syntase, GS og brytes ned av glykogen fosforylase, GP og glykogen fosforylase kinase, GPK. • GS inaktiveres ved fosforylering, mens GP og GPK aktiveres ved fosforylering.

34. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Fosfoprotein fosfatase • Fosfoprotein fosfatase (PP) er et protein som fjerner fosfatet fra inaktiv glykogen syntase, og dermed aktiver denne. Samtidig fjerner fosforprotein fosfatase fosfatet fra glykogen fosfatase og glykogen fosfatase kinase. • Aktiviteten til fosfoprotein fosfatase reguleres indirekte av cAMP-nivået i en celle. Ved høyt cAMP-nivå vil cAPK fosforylere et inhibitorprotein (IP) som dermed bindes til fosfoprotein fosfatasen. Dette komplekset av IP og PP mangler fosfataseaktivitet, og glykogensyntetisering hemmes. • Ved minkende cAMP-nivå i cellen vil inhibitorproteinet defosforyleres, ogfosfoprotein fosfatasen frigis i sin aktive form.

35. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Fordelen med kinase kaskader • Definisjon: En kaskade er en serie reaksjoner hvor enzymet som katalyserer ett trinn i syntesen av ett stoff, aktiveres (eller inaktiveres) av produktet av det forrige trinnet. • Fordel 1: En kaskade tillater en stor gruppe enzymkatalyserte reaksjoner reguleres av en felles enzymtype. • Fordel 2: Kaskaden innebærer kraftig forsterkning av et signal som i utgangspunktet er relativt svakt.

36. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Ankerproteiner • Økt nivå av cAMP i en celle produserer en respons som vanligvis er nødvendig i en del av en celle, men som kan være skadelig for andre deler av den samme cellen. For å forhindre at skader oppstår dirigerer ankerproteiner cAMP til spesifikke lokasjoner i cellen. Slike ankerproteiner er for eksempel cAMP kinase assosierte proteiner (cAPK’er). • Enkelte ankerproteiner integrerer informasjon fra ulike signaliseringsveier og bidrar dermed til å oppnå lokal kontroll over ulike cellulære prosesser.

37. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter DAG og IP3 - to sekundære budbringereinositol-lipid sporet: • Flere sekundære metabolitter stammer fra fosfolipidet fosfatidylinositol (PI).Inositolgruppen som vender inn mot cytosol kan reversibelt fosforyleres og gi opphav til membranbundet fosfoinositider. • PI fosforyleres av aktiverte PI-kinaser, der denne aktiviteten kan stimuleres av både GPCR og RTK. • Fosfolipase C (PLC) kan kløyve PI og generere 1,2-diacylglycerol (DAG) og frie fosforylerte inositoler (eks inositol 1,4,5-trifosfat (IP3)).

38. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Hormonindusert frigjøring av Ca2+ fra ER er IP3-mediert: • Liten økning av [Ca2+] i cytosol resulterer i en rekke cellulære responser. • Mesteparten av Ca2+ er i mitokondrier, ER eller andre vesikler, og cellen har ulike mekanismer for regulere [Ca2+] i cytosol. • Binding av hormoner til reseptor medfører økt [Ca2+] i cytosol ved influx fra f.eks ER, via signaltransduksjon fra reseptoren til Ca2+-kanaler på ER. Signaltransduksjonen utføres av IP3 som diffunderer fra plasmamembranen til IP3-sensitive Ca2+-kanaler på ER • Økt [Ca2+]i cytosol er kun transient, Ca2+-ATPaser pumper Ca2+ ut av cellen eller inn i ER. I tillegg har IP3 kort levetid. • Ca2+-lagre fylles opp igjen via ionekanaler i plasmamembranen,- store-operated channels (SOC), som åpnes ved lav [Ca2+] i lagrene. • For høye [Ca2+] inhiberes IP3-indusert frigjøring ved å senke affiniteten til reseptoren for IP3.

39. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Åpning av Ryanodin reseptor frigjør Ca2+lagre i muskel og nervecelle: • Muskler og nerveceller har i tillegg til IP3-sensitive Ca2+-kanaler andre Ca2+-kanaler ~Ryanodin reseptor (RYR). • I skjellettmuskelceller er reseptoren lokalisert i SR assosiert med et spenningssensitivt protein. Forandringer i potensial over membranen induserer konformasjonsendring i RYR og Ca2+ frigjøres fra SR til cytosol. • Denne Ca2+-frigjøringen fra SR er tilstrekkelig for å oppnå muskelkontraksjon, mens IP3-indusert Ca2+-frigjøring krever aktivering av SOC for å oppnå cellulær respons. • Regulering: Økt [Ca2+] i cytosol stimulerer RYR videre, men økt nivå inhiberer ikke på samme måte som for de IP3-sensitive kanalene! RYR lukkes først når muskelcellen depolariserer igjen.

40. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Ca2+calmodulin compleks medierer cellulære responser: • Økt nivå av Ca2+ i cytosol er kritisk for rollen til Ca2+ som sekundær budbringer. • F.eks i noen sekreterende celler vil økt nivå av Ca2+ i cytosol trigge exocytose av sekreterede vesikler. • Liten økning av [Ca2+] i cytosol og assosiert cellulær respons er som nevnt ofte et resultat av hormon-indusert økning av IP3. • Calmodulin medierer mange ulike effekter av Ca2+. Hvert molekyl binder 4 Ca2+, som resulterer i konformasjonsendring og dermed muligheten for Calmodulin-Ca2+ komplekset å aktivere enzymer. På den måten får Ca2+ utøvet sin rolle som sekundær metabolitt! • Eks: cAMPfosfodiesterase blir aktivert av Calmodulin-Ca2+ og degraderer cAMP. Denne reaksjonen linker cAMP og Ca2+, et av mange eksempler på hvordan to sekundære metabolitter sammen utøver cellulær regulering! • Eks: Calmodulin-Ca2+ aktiverer kinaser som igjen fosforylerer transkripsjonsfaktorer og på den måten regulerer gentranskripsjon.

41. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter DAG aktiverer PKC, som regulerer andre proteiner: • DAG forblir assosiert med membranen etter hydrolyse av PIP2 og frigjøring IP3. Prinsipiell funksjon er å aktivere protein kinase C. • PKC foreligger inaktiv i cytosol. Økt [Ca2+]i cytosol får PKC til å binde seg til membranen og blir der aktivert av DAG. - En kombinasjon av to ulike grener fra inositol-lipid signalsporet for å aktivere PKC? • Aktivering av PKC resulterer i en rekke responser avhengig av celletype, noe som indikerer at PKC spiller en viktig rolle ved cellevekst og metabolisme • PKC fosforylerer også en rekke transkripsjonsfaktorer avhengig av celletype, og disse induserer eller hindrer syntese av bestemte mRNA.

42. Kap. 20.6 Sekundære metabolitter Syntese av cGMP induseres av både peptidhormoner og NO (Nitric Oxide): • Syntese av cGMP katalyseres av to typer guanylat cyklaser: løselig og transmembran. • Transmembran form utgjør cytosolisk domene av overflatereseptor for peptidhormon. Binding av ligand promoterer aktivitet av guanylat cyklase og formasjon av cGMP. (fig 20-3 d) • Løselig form aktiveres av NO. Heterodimer med bundet heme molekyl. Binding av NO medfører konformasjonsendring og stimulerer katalytisk aktivitet. • NO syntetiseres av NO syntase som katalyserer formasjonen av NO fra arginin og O2. • NO har en viktig rolle i mange cellulære interaksjoner, som f.eks ved kontrollen av glatt muskelcelle (Fig 20-42 b)