Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002 Cell Motility and Shape I: Microfilaments - Kap. 18

1. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002 Cell Motility and Shape I: Microfilaments - Kap. 18 Tor-Henning Iversen Plantebiosenteret, Biologisk Institutt, NTNU, 7491 Trondheim • PBS`hjemmeside :www.plantebiosenteret.no • e-mail : Tor-Henning.Iversen@chembio.ntnu.no

2. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Emner som gjennomgåes Innledning • Actin Cytoskjellett (Del 18.1) : • Høyt konservert actin i eukaryoter • G- og F-actin • Organisering av actin cytoskjellett • Cellemembranen og kortikulært actin-nettverk • Erythrocytt- og plate-cytoskjellett • Actin - dynamikk (Del 18.2) : • Actin-polymerisering skjer i tre trinn • Polarisert vekst av actin-filamenter • Regulering av actin-polymerisering • Actin-polymerisering og bevegelser

3. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Emner som gjennomgåes • Myosin - actin motorprotein (Del 18.3) • Oppbygging av myosiner • Myosin-bevegelser • Myosin og kinesin - felles opphav ? • Myosin-konformasjonsendringer og ATP • Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Skjellett-muskler inneholder actin og myosin • Bevegelse av tykke og tynne filamenter under kontraksjon • Titin og nebulin-filamenter • Cytosolisk kalsium og muskel-kontraksjon • Actin-bindingsproteiner og kontraksjons-regulering • Myosin og muskelkontraksjon

4. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Emner som gjennomgåes • Actin og Myosin i ikke-muskelceller (Del 18.5) • Actin og myosin II i celleadhesjon • Actin og myosin II i cytokinese • Membranbundet myosin og vesikel-bevegelse • Cellebevegelse (Del 18.6) • Keratinocyt-bevegelse og actin-filamenter • Amøboide bevegelser og actin-nettverk • Mysosin I og II og cellebevegelse

5. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Innledning • Cellebevegelse omfatter forflytninger innen en celle eller av hele celler (f.eks. encellede organismer) • Cellebevegelsen er et resultat av et mekanisk arbeid dvs. krever ATP og proteiner som kan omforme energien fra ATP over til bevegelse • Cytoskjellettet spiller en sentral rolle i cellebevegelsen ved å gjennomgå rearrangementer som kan produsere bevegelser. • Cytoskjellettet består av tre typer cytosoliske fibre : • Mikrofilamenter • Intermediære filamenter • Mikrotubuli • Cellen har utviklet to mekanismer for å igangsette bevegelser : • Bruk av motor-proteiner (enzymer) • Opp- og nedbygging av mikrofilamenter og mikrotubuli

6. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) • Innledningsvis er det beskrevet to typer av bevegelser hos dyreceller ; a) en hudcelle (keratinocytt) som ligner amøber med deres hurtige bevegelse og b) en saktebevegende fibroblast. • Maskineriet for cellebevegelsen er bygget fra actin-cytoskjellettet som kan visualiseres ved fluorescens-mikroskopi av en vifteformet fibroblast etter farging f.eks. ved bruk av rhodamine phalloidin (se Figure 18-1b). • Pga størrelsen kan de store actin-filament-strukturene endre cellens morfologi bare ved opp- og ned-bygging. Figure 18-1b

7. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) • Høyt konservert actin i eukaryoter • Actin utgjør fra 1-10% av totalt protein i celler dvs. en betydelig del av cellens protein. • Enkle encellete eukaryoter (gjær og amøber) har ett enkelt actin-gen mens de mer komplekse har multiple actin-gener med utgangspunkt i en stor høyt konservert genfamilie. • Mennesket har 6 actin-gener som koder for isoformer av proteiner, mens enkelte planter har 60 actin-gener. • Til tross for minimale forskjeller mellom isoformene har de ulike funksjoner - sml. -actin i kontraktile strukturer med -actin som er i fronten av cellen hvor actin-filamentene polymeriserer. • Nylig er det i eukaryote påvist en familie av actin-relaterte proteiner (Arps) som har 50% homologi med actin.

8. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) • G- og F-actin • Actin finnes både som globulære monomere (G-actin) og som linære filamentøse polymere (F-actin). • Hvert actin-molekyl inneholder Mg2+ i komplekser med ATP og ADP. • ATP (rød) og Mg2+ (gul) er bundet i en ATP-bindings-kløft som sammen med to fliker (lobes) kalles en ATPase-fold - se modell av -actin monomer med fire subdomain (I-IV) i Figure 18-2a. • Tilførsel av ioner (Mg2+ , K+ , Na+ ) til en løsning med G-actin starter en polymerisering av G-actin til F-actin-filamenter (kan reverseres ved reduksjon av ionestyrken). Denne reversibiliteten er en viktig egenskap ved actin. • Bilder av tvinnede F-actin filamenter er vist i Figure 18-2b (TEM, negativ farging) og basert på monomeren i Figure 18-2a av en helix-modell av actin-underenheter (Figure 18-2c). Merk (-) og (+) enden på filament-modellen - noe som viser polaritetsegenskaper. Figure 18-2

9. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) • Organisering av actin cytoskjellett • På Figure 18-4 (plasmamembranen er fjernet) er vist den typiske form som cytoskjellettet kan observeres på i cellen. Actin-bunter (bundles) går ut fra cellen som eike(spoke)-lignende filopodier mens actin-filamenter danner et nettverk som fyller hele cytosol. • Både bunter og nettverk støtter opp om plasmamembranen og bestemmer derved cellens form. • Buntene er bygget av tettpakkete og paralelle actin-filamenter mens i nettverket - som kan være 2D eller 3D - ligger filamentene i kryss (oftest i rette vinkler). • Filamentene holdes sammen av actin-kryssbindende proteiner f.eks. fascin (kort protein i bunter) og filamin (langt protein i nettverk) - se Figure 18-5. Figure 18-4 Figure 18-5

10. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) • Organisering av actin cytoskjellett (forts.) • Mange av kryssbindingsproteinene tilhører calpolin-homology-domain (CH-domain) superfamilien (Table 18-1). Hvert av disse proteinene har et par actin-bindende domainer som har sekvenser homologe med calpolin (et muskelprotein).

11. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) Cellemembranen og kortikulært actin-nettverk • Cellens form avhenger både av actin-filamentene og de proteiner (membran-mikrofilament bindingsproteiner) som knytter filamentene til cellemembranen. • De mest omfattende nettverksområder med actin-filamenter ligger i cortex - en smal sone under cellemembranen - derav betegnelsen kortikulært actin-nettverk. • Det finnes ”fingerlignende” overflatestrukturer f.eks. mikrovilli (Figure 18-10) i epitelceller i tynntarmen og filopodier som understøttes av actin-filamenter. På figuren kan man se de ulike koblinger mikrovilli har til spectrin og keratin. • Ulike måter å organisere det kortikulære nettverket kan demonstreres i det enkle erythrocytoskjellettet og det mer kompliserte plate- og epitel-cytoskjellettet og i muskler (neste ark). Figure 18-10

12. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) Figure 18-6 • Erythrocytt- og plate-cytoskjellett • Erythrocytt-cytoskjellettet gir blodlegemene styrke og fleksibilitet. • Viktigste komponent er fiber-proteinet spectrin som danner lange eiker med mørkere felt av ankyrin (Figure 18-6) - et integralt protein. Hver spectrin-tetramer utgjør en eike som går ut fra junctional complexes (Figure 18-7) som består av et actin-filament, adducin, tropomyosin og tropomodulin. • Band 4.1-protein er også en del av et junctional complex og bindes til det integrale membran-proteinet glycophorin. Figure 18-7

13. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin Cytoskjellett (Del 18.1) Figure 18-8 • Erythrocytt- og plate-cytoskjellett (forts.) • Platecytoskjellettet er mer komplisert enn erythrocytt-skjellettet. • Et eksempel på kompliserte actin-skjellett-rearrangementer er vist i Figure 18-8 - fra venstre: hvilende celler, koagulering, oppløsning av koagulat. • Den ikke-kjernete platecellen som er viktig i blodkoagulering og sårheling, har evne til å overføre endringer av cytoskjellettet inne i cellen til såret på utsiden via felles kontakt med proteinet Gp1b-IX (Figure 18-9a) • Medisin: Membran-cytoskjellett er av betydning for både muskel-dystrofi (genfeil for prod. av dystrophin) og cystisk fibrose (Figure 18-9b og c) Figure 18-9

14. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin - dynamikk (Del 18.2) • Actin-polymerisering skjer i tre trinn • Mikrofilamentene er i stadig ned- og oppbygging dvs. dynamiske, noe som igjen reflekteres i store endringer i cellens form. • Polymerisering fra globulært G-actin til F-actin filamenter skjer ved tilsetting av salter og kan måles ved viskositet, sedimentering og fluorescens spektroskopi. • Polymeriseringen in vitro skjer i tre påfølgende faser (Figure 18-11): • Fase 1: En lag-periode hvor ATP-G-actin danner korte, ustabile oligomerer (”kjerner”) • Fase 2 : Kjernene forlenges til F-actin filamenter ved påleiring av actin monomerer til begge ender • Fase 3 : ”Steady state” hvor ATP-G-actin-monomerer skiftes ut ved endene av filamentene. Den stabile delen av filamentet er hvit på Figure 18-11. Figure 18-11

15. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin - dynamikk (Del 18.2) Figure 18-13 Polarisert vekst av actin-filamenter • (+)-enden av F-actin filamentene vokser 5-10 ganger raskere enn (-)-enden • Forskjellen i veksthastighet kan demonstreres eksperimentelt ved blokkering av påleiring av ATP-G-actin monomerer (capping protein) til de respektive ender (Figure 18-13b). • Polymeriseringen er avhengig av en kritisk konsentrasjon (Cc) av G-actin monomerene i likevekt med actin-filamenter. Under Cc vil det ikke skje en polymerisering - over skjer denne inntil Cc nåes (Figure 18-12 b). Mellom disse Cc-konsentrasjonene for (+) og (-)enden kan actin-monomerene flyte gjennom filamentet fra (+) mot (-)-enden (Figure 18-13c) hvor det avsnøres -”tredemølle”-prinsippet. • Flere toksiner påvirker likevekten mellom actin-monomerene og filamentene ; cytochalasin D (blokkerer påleiring av monomerer ved (+)-enden), latrunculin binder opp G-actin og hindrer påleiring og phalloidin som låser underenheter sammen og hindrer depolymerisering.

16. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin - dynamikk (Del 18.2) • Regulering av actin-polymerisering • I reagensrøret kan actin-polymeriseringen startes ved tilsetting av salter til G-actin, eller depolymerisering av F-actin kan skje ved fortynning av filamentene • I cellen skjer derimot reguleringen av polymeriseringen ved hjelp av cytosoliske actin-bindingsproteiner: to eksempler er tatt med - Thymosin 4 og Profilin. • Målinger av G-actin viser opp til 40% i cellen mens nivået teoretisk skulle vært meget lavt. Det høye nivået opprettholdes ved at cellen bruker Thymosin 4(T4 ) og danner et kompleks med ATP-G-actin som hindrer polymeriseringen av G-actin. T4 virker som en buffer for monomert actin : F-actin G-actin + T4 G-actin/ T4 • Profilin fremmer actin polymeriseringen på flere måter. Figure 18-14 viser at profilin bindes til kanten av subdomain I (kfr. Figure 18-2) noe som gir den frie ATP-bindingsenden [(-) enden] muligheten til å assosieres med (+)enden av filamentet - før profilinet fjernes igjen. Figure 18-14

17. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin - dynamikk (Del 18.2) Figure 18-15 • Regulering av actin-polymerisering (forts.) • Figure 18-15 viser ulike mekanismer for profilin: a. Ikke-aktivisert er profilin bundet til et cellemembranlipid (PIP2) mens T4 binder ATP-G-actin, b. Aktivisert etter et cellesignal (kjemotaktisk molekyl) hydrolyseres profilin fra membranen og inntar T4 -plassen som gir profilin-G-actin komplekser som kan samles til filamenter.c. Profilin-G-actin kompleksene samvirker med prolin-rike proteiner i membranen hvor profilin henger på actin-monomerer til (+) enden av filamentene. d. ADP-G-actin underenheter som har dissosiert fra filamentene omformes til ATP-G-actin av profilin og øker derved cellens pool av ATP-G-actin.

18. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin - dynamikk (Del 18.2) • Regulering av actin-polymerisering (forts.) • To proteiner (Table 18-2) - gelsolin og cofilin - kontrollerer lengden på aktin-filamentene ved å korte dem ned til fragmenter. • Virkningsmekanismen for denne avkortingen - som skjer etter tilførsel av Ca2+ og ved signalmolekyler - er vist i Figure 18-16. Prosessen kalles avkutting (capping) og det dannes nye (-) ender samtidig som actin-nettverket oppløses. • Også andre proteiner (CapZ og Tropomodulin) kan sørge for avkutting, men her dannes ikke nye (-)ender. Figure 18-16

19. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin - dynamikk (Del 18.2) • Actin-polymerisering og bevegelser • Ved actin-polymerisering og depolymerisering kan cellen skape krefter som kan produsere bevegelser f.eks. i den klassiske acrosome-reaksjonen i en sjøpinnsvin-sperm-celle (se Figure 18-17 og teksten i boken). • Noen bakterier (f.eks. Listeria sp. fra en gravid kvinne til fosteret) og virus unnslipper fra en infisert celle koblet til enden av et actin-filament. Actinet sikrer den kraften som er nødvendig for bevegelsen. • På Figure 18-18 er vist antistoff-fargete røde bakterier som binder cellulært profilin. Bak hver bakterie er en hale av actin farget med fluorescerende phalloidin (grønt). Bakteriene overføres til andre celler ved fagocytose. • Figure 18-19 viser hvordan polymerisering av actin og profilin i membranen på leading edge av en fibroblast-celle medfører at cellen kan ”krype” bortover overflaten. Figure 18-18 Figure 18-19

20. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Myosin - actin motorprotein (Del 18.3) • Oppbygging av myosiner • Mange cellulære bevegelser er basert på samvirke mellom actin-filamenter og myosin - en ATPase også kalt et mekanokjemisk enzym eller et motorprotein (myosin=motor, actin-filamentet=sporene og ATP= brennstoffet). • Kontraksjon -dvs. resultatet av samvirket mellom actin-filamenter og myosinet -skjer i muskelceller. • Det er kjent 13 medlemmer i myosin-genfamilien. Myosin I og II samt V er godt karakterisert og fungerer som motorproteiner - Myosin II:muskel-kontraksjon + cytokinese, MI og MV :transport av vesikler dvs. cytoskjellett/membran-interaksjoner. • Struktur av myosin (Figure 18-20): 1-2 tunge og flere lette kjeder (regulerer hodet), globulært hode (m/actin og ATP-bindingseter), et nakke (neck)-område og en hale (bestemmer spesifikk rolle for hvert myosin). • Calmodulin (en Ca2+ -bindende regulatorisk underenhet) utgjør den lette kjeden i Myosin I og V. Lette kjeder (essentiell og regulatorisk) i Myosin II er også Ca2+ -bindende proteiner. De ulike myosiner reagerer forskjellig på Ca2+ -signaler. Figure 18-20

21. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Myosin - actin motorprotein (Del 18.3) • Myosin-bevegelser • Studier av muskel-celler viser at myosin-hodene vandrer/beveger seg langs actin-filamenter. • Ved bruk av fluorescens-teknikk gjennomføres sliding-filament assay på et dekkglass. Myosin-molekylene som er festet til glasset kan ikke bevege seg mens myosin-hodene reagerer med actin-filamentene som glir langs myosin-laget når ATP er tilstede (Figure 18-22a). Actin-filamentene beveger seg alltid med (-)enden foran. • Myosin-hodene beveges i diskrete trinn som hver er koblet til hydrolyse av ett ATP-molekyl. Dette kan måles i en optical trap. Figure 18-22a

22. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Myosin - actin motorprotein (Del 18.3) Figure 18-24 • Myosin og kinesin - felles opphav ? • Røntgen-krystallografiske analyser av myosin S1-fragmenter har gitt mye kunnskap om form, posisjonen til de regulatoriske lette kjeder og ATP- og actin-bindingstedene (Figure 18-24). • Strukturelt ligner myosin på kinesin - et mikrotubuli-motorprotein (Kap. 19). Begge inneholder Ras-folden som antyder et felles opphav fra gamle nukleotid-bindingsproteiner. • Myosin-konformasjonsendringer og ATP • I Figure 18-25 er vist hvordan ATP-hydrolyse er koblet til bevegelsen av myosin langs et actin-filament. Figure 18-25

23. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Skjellett-muskler inneholder actin og myosin • I muskler danner actin og myosin et kompleks kalt acto-myosin som kan effektivt utføre et arbeid. • Muskelarbeidet er karakterisert ved power output og er f.eks. 330.000 ganger høyere enn for mitotisk spindel som separerer kromosomene. • Må skille mellom skjellett-muskler og glatte muskler. De fundamentale funksjoner av disse to typer forutsettes at man har kunnskap om fra fysiologiemner. • Skjellett-muskler består av en bunt flerkjernete muskelceller eller myofibre (Figure 18-26a). Hver celle er pakket med actin- og myosin-filamenter som er organisert i myofibriller som i sin tur er bygget opp av lyse (I-band) og mørke ( A-bånd) bånd. Dette gir en stripet form på myofiberen. Øvrige elementer er H-sone, Z-sone og kjeder av sarcomerer (de funksjonelle enheter under kontraksjonen). Figure 18-26

24. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Bevegelse av tykke og tynne filamenter under kontraksjon • Hver sarcomer inneholder to typer filamenter - tykke filamenter (myosin II) og tynne filamenter (actin). • Figure 18-27 viser sarcomerens struktur: a. lengdesnitt i TEM- svakt farget. På hver side av Z-disk er lyse I-band av actin-filamenter som infilterer de mørke myosin-tykke filamenter og utgjør A-band. • Den mørke AI-zonen inneholder både tykke og tynne filamenter mens den lyse H-zonen inneholder kun tykke myosin filamenter. Den primære oppgaven til Z-disken er å forankre (+)endene av actin-filamentene. Figure 18-27

25. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Bevegelse av tykke og tynne filamenter under kontraksjon (forts.) • Ifølge ”Sliding-filament”-modellen vil ikke tykke og tynne filamenter endre lengde når sarcomeren forkortes (Figure 18-29). På øvre del av figuren er vist tykke mysosin- og tynne actin-filamenter når muskelen er avslappet. • I nærvær av ATP og Ca2+ vil myosin-hodene under kontraksjonen vandre langsetter og trekke de tynne actin-filamenter mot sentrum av sarcomeren. Siden de tynne filamentene er forankret i Z-disken, vil derved sarcomerens lengde reduseres under kontraksjonen av muskelen. Figure 18-29

26. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Titin og nebulin-filamenter • En muskel er elastisk som et gummiband. Den innebyggete elastisiteten skyldes ekstremt lange proteiner - kalt titin (=connectin) og nebulin - som organiserer de tykke og tynne filamenter i deres 3D-mønstre (Figure 18-30). • Titin forbinder endene av myosin-tykke filamenter til Z-disken og fortsetter langs de tykke filamentene til H-sonen. Lengden på titin (MW 2.700.000) er 1 µm dvs. halve sarcomer-lengden. • Nebulin (MW 700.000) danner lange ikke-elastiske filamenter som opprett-holder mønsteret til de tynne filamentene. • Behandling med proteinet gelsolin fjerner de tynne filamenter, nebulin kondenserer ved Z-disken og lar titin-filamentene og myosin-tykke filamenter være tilbake. Figure 18-30

27. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Cytosolisk kalsium og muskel-kontraksjon • Muskelkontraksjon startes ved en økning i den cytosoliske Ca2+ -konsentrasjonen • I skjellett-muskel-celler opprettholdes et lavt Ca2+ -innhold i hvile ved bruk av Ca2+ - ATPase i det sarcoplasmatiske retikulum (SR). • Når en nerveimpuls (depolarisering) når frem til muskelcellen, endres det elektriske potensialet over plasmamembranen som fører til en økning i den cytosoliske Ca2+ -konsentrasjonen. Dette kjemiske signalet starter kontraksjonen av muskelen. • Detaljer i den anatomiske struktur og mekanismen er vist i Figure 18-31. Sentralt her er invagineringer i membranen (transverse (T) -tubules)som danner strukturer kalt triader nær SR. Figure 18-31

28. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Actin-bindingsproteiner og kontraksjons-regulering • Actin-bindingsproteinene tropomyosin (TM) og troponin (TN) vil ved styring av Ca2+ -signalet regulere kontraksjonen i både skjellett- og glatte muskler. • Ca2+ -konsentrasjonen påvirker posisjonen av disse proteinene i de tynne filamenter som i sin tur kontrollerer myosin-actin-interaksjoner. • TM er bundet sammen fra hode til hale langs hvert actin-filament, og bindes til TN gjennom et kompleks av tre underenheter (TN-T, TN-I og TN-C). TN-C er den kalsium-bindende underenheten og kontrollerer - gjennom TN-T og TN-I -posisjonen av TM på overflaten av et actin-filament (Figure 18-32). • Det er antatt at TM under påvirkning av Ca2+ kan innta to posisjoner på de tynne filamentene - en ”off” og en ”on” tilstand. Figure 18-32

29. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Muskler - En spesialisert kontraktil maskin (Del 18.4) • Myosin og muskelkontraksjon • Både glatte - og invertebrat-skjellettmuskelceller kan reguleres med utgangspunkt i myosin og ikke actin som er nevnt foran. • Reguleringen her skjer ved at Ca2+ aktiviserer myosin på to måter : 1. ved binding til regulatoriske lette myosin-kjeder eller 2. ved stimulering av kalsium-avhengig fosforylering av de lette kjeder. For detaljer se Figure 18-34.

30. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin og Myosin i ikke-muskelceller (Del 18.5) • Actin og myosin II i celleadhesjon • Ikke-muskel-celler har betydelige mengder actin og myosin II filamenter i de deler av en celle som er i kontakt med et substrat eller andre celler. • I ikke-muskel-celler vil actin-buntene utgjøre den sentrale del av f.eks. mikrovilli eller filopodier. Mens mysosin er tett bygget inn i kontraktile actin-bunter, finnes det kun litt myosin II i ikke-muskel-celler . • I epitel-celler finnes kontraktile elementer som et ”circumferential belt” lokalisert nær den apikale overflate av cellen (Figure 18-35). Dette medvirker ved kontroll av cellens form og ved sårheling. • I celler som dyrkes i overflaten på glass/plast finnes stress-fibre som er bunter av actin-mikrofilamenter. Man antar at disse - til tross for at de er kontraktile - fungerer ved celle-adhesjon fremfor ved bevegelse. Figure 18-35

31. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin og Myosin i ikke-muskelceller (Del 18.5) • Actin og myosin II i cytokinese • Actin og myosin II vil under mitose samles opp i ekvatorplanet i en celle i deling hvor de danner en kontraktil ring (ligner stress-fiber og circumferential belt). • Mens myosin II finnes i den kontraktile ring finnes myosin I ved cellens poler (Figure 18-37). • Betydningen av myosin II under cytokinesen er vist i det praktiske forsøket skissert i Figure 18-38. Figure 18-38 Figure 18-37

32. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Actin og Myosin i ikke-muskelceller (Del 18.5) • Membranbundet myosin og vesikel-bevegelse • Hvordan transport av vesikler i cytosol foregår har forundret forskerne. Idag antar man at vesiklene styres i spor av actin-filamenter eller mikrotubuli og med et motorprotein som kraftkilde. • Det er funnet at mysosin I og myosin V kan bevege seg langs actin-filamenter med en vesikel som cargo. • Flere eksempler er nevnt på slik transport f.eks. i tynntarm-epitelceller deltar myosin I i Golgi-vesikel transport. • Membran bundet myosin er også viktig i cytoplasmastrømninger i de store algene Nitella og Chara. Her er det observert at bunter av actin-filamenter tett knyttet til ER, finnes lang cellens lengdeakse. Viskøse cytosol-strømmer drives av myosin-motor-protein (blå prikker) knyttet til ER langs de stasjonære actin-filamentene (røde) (Figure 18-40a). • TEM-bildet (Figure 18-40b) viser en stor vesikel bundet til underliggende actin-filamenter. Figure 18-40

33. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Cellebevegelse (Del 18.6) • Keratinocyt-bevegelse og actin-filamenter • I en hurtig-bevegende keratinocyt starter bevegelsen av cellen med dannelsen av et lammelipodium (Figure 18-41) som følges av en kontrollert polymerisering av actin-filamenter fra cellens leading edge med påfølgende kryssbinding i bunter og nettverk (Figure 18-42). • Det antas at membranen skyves fremover pga polymerisering av actin-filamentene før den forankres til substrat-overflaten. Etterslepet dvs. de-adhesion skjer ved at focal adhesion blir brutt og bakre del av cellen skyves fremover. Figure 18-42 Figure 18-41

34. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Cellebevegelse (Del 18.6) • Amøboide bevegelser og actin-nettverk • Bevegelser hos amøber ligner bevegelsen hos keratinocyter. Starter med at plasmamembranen danner en ”falsk fot” (pseudopodium) - sml. lamellipodium hos vertebrater. Fester seg på underlaget og fylles med cytosol som strømmer frem i cellen.Deretter trekkes resten av amøben forover og bryter opprinnelig kontaktpunkt med underlaget. • Bevegelsen følges av endringer i cytosolets viskositet som svinger mellom en flytende (sol) og en gel-tilstand. Det sentrale endoplasmaet (flytende del) strømmer raskt til cellens fremdel dvs. psudopodiet hvor endoplasmaet --> ectoplasma (gel). Det hele reverseres etter som cellen beveges forover. • Omformingen av gel->sol->gel skyldes ned- og oppbygging av actin-mikrofilamenter i cytosol regulert av actin-bindingsproteiner (profilin, actinin, filamin og cofilin).

35. Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 1. oktober 2002Cellebevegelse (Del 18.6) • Mysosin I og II og cellebevegelse • Ved bruk av antistoff/immunofluorescens er myosin I og II lokalisert i bevegelige amøber til respektivt leading edge (grønn) og halen (rød) (Figure 18-43a). Tyder på at myosin I er viktig for bevegelse fremover - myosin II for tilbaketrekking. Figure 18-43