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Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis

2010. 26 a 30 de Julho. Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis. Responsável: Ana Melo Monitores: Pedro Sousa Filipe Santos. Participantes: Carolina Camelo Inês Santos Magda Paiva Sara Silva. Cadeia respiratória de B. subtilis.

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Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis

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  1. 2010 26 a 30 de Julho Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis Responsável: Ana Melo Monitores: Pedro Sousa Filipe Santos Participantes: Carolina Camelo Inês Santos Magda Paiva Sara Silva

  2. Cadeia respiratória de B. subtilis

  3. Amplificação do gene codificante da subunidade A da citocromo c oxidase (qoxA) de B. subtilis. Colónia Wt (2x) H2O Milipore Ferver 5 min. ΔqoxA (1x) Δ qoxB (1x) Lise celular Desnaturação DNAses 1 min. a 12000 RPM WT PCR de Colónias qoxB (100 bp) DNA H2O estéril Tampão dNTP Primer Fw Primer Rev Taq Polimerase Marcador gap (>100 bp) qoxA (100 bp) Gel de agarose

  4. Ligação do gene ao vector plasmídico (pSKEcoRV) qoxA GTGATCCTCTTGTTCAGAGCATTTAAACCACTGATTATGCTGACTCTGCTTTCCTCCGTTTTTTTATTGGGCGGCTGCAGTCAAATCGCGGTATTGGAT Ligação H2O estéril Tampão da ligase pSKEcoRV (desfosforilado) Produto de PCR (qoxA ou qoxB) T4 DNA ligase 22ºC

  5. Transformação do produto da ligação nas células de E. coli. Produto da ligação: pSK_qoxA Transformação 37ºC Ecoli XL1Blue Incubar overnight Colónias de bactérias com plasmídeo sem produto de ligação Colónias de bactérias com plasmídeo com produto de ligação

  6. Espectros de UV/Visível de B. subtilis Cadeia respiratória de B. subtilis cytc bc1 caa3 NDH-2 aa3 Q SDH bd Podemos concluir que as oxidases terminais caa3 e bd da cadeia respiratória de B. subtilis estão presentes neste crescimento.

  7. Actividades enzimáticas Actividade NADH:K3[Fe(CN)6] oxidorredutase= 110 nmol NADH min-1 mg-1 Actividade succinato:DCPIP oxidorredutase = 151,7 nmol DCPIP min-1 mg-1

  8. BN-PAGE Massa Molecular dos complexos isolados NDH-2  45 kDa caa3  145 kDa aa3 147 kDa bc1  73 kDa SDH  116 kDa bd  218 kDa ou 90 kDa • Supercomplexos identificados: • (SDH)3 • NDH-2:(SDH)3 Banda 7 Bandas 2 e 6 Nota: É necessário confirmar os resultados obtidos por Espectrometria de Massa

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