Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung

1. Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

2. Übersicht • Motivation • Messapparatur • Aufbau • Optimierung der Einstellungen • Durchführung der Messungen • Auswertung • Normierung der Messdaten • Faltung der Messdaten • Korngrößenabhängigkeit • Zusammenfassung & Ausblick • Quellen PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

3. Motivation – Bacillus subtilis • Bakterium „Bacillus subtilis“ ist Endosporenbildner • Endosporen Ähnlichkeit zu • Bacillus anthracis • Clostridium botulinum • Clostridium tetani • Große Mengen vonkristallinem Ca-DPAim „Core“ • Rest besteht aus nicht-kristallinen Proteinen,DNA, etc… PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 4

4. Motivation – Calcium Dipicolinat (Ca-DPA) • Ca-DPA ist Salz der Dipicolinsäure,welche ebenfalls in einigen Sporenzu finden ist. • Ca-DPA = C7H3CaNO4bildet monoklines Gitter mit 4Molekülen / Zelle • Spektroskopisch viel untersuchteSubstanz, jedoch kaum mittels EDX. • Detektion interessant für Brief- &Paketscanner etc. PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 5

5. Messapparatur – Schematischer Aufbau z Fokus x Primär- kollimator q p Objektpunkt 3D - Objekt eff. Streuwinkel q s Streu- L kollimator fokussierter Röntgenstrahl PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 8

6. Messapparatur – Änderung des Messwinkels z z x x y y L L PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 9

7. Messapparatur – Änderung der Streublendenöffnung z z x x y y A A A A PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 10

8. Röhren-Parameter & Datenaufnahme • wesentliche Bestandteile der Röntgenanlage • X-Ray-Tube (Philips) mit Wolfram-Röntgenanode: • energieauflösender Ge-Halbleiter-Detektor (Eurisys Mesures) • Röhren-Parameter • Beschleunigungspannung bis 150keV • Anodenstrom bis 10mA • Datenaufnahme • Vorbereitungen für die Datenauswertung • Energie-Kanal-Eichung mittels charakteristischer Linien: in Kanal ; in Kanal Detektorspannung ( E) Vorverstärker MCA (2048 Kanäle) mit ADC „winTMCA“ (PC-Software) Kanalnummer Energie [keV] PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 11

9. Normierung des Beugungsspektrums • Problem: • Lösung: • Vorgehensweise: • Aufnahme des Transmissionsspektrums: Detektion ungebeugter Photonen bei geringem Anodenstrom (I=1mA um Detektor nicht zu schädigen) • Division des Beugungs- durch das Transmissionsspektrum (Für manche Energien ist die Intensität im Transmissionsspektrum nahe null Hohe Intensitäten im Divisionsspektrum, allerdings lediglich in uninteressanten Randbereichen.) Strahlungsintensität über Energien nicht konstant (aufgrund Bremsstrahlung & charakteristischer Linien) Normierung des Beugungsspektrums mittels Transmissionsspektrum: Abgesehen von Rauscheffekten lässt sich so obige Intensitätsabhängigkeit herausfiltern PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 12

10. Messapparatur – Optimierung (I) • Vormessung mit Dipicolinsäure • Bestimmung der Netzebenen- • abstände d mittels Gauß-Fit PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 13

11. Messapparatur Optimierung (II) – mit xSim2001 v1.0 • xSim2001 v1.0 • Im Rahmen einer Diplom-Arbeit für diese Röntgenanlage erstelltes Simulationsprogramm • basierend auf „Monte Carlo Verfahren“ • Anlagenparameter einstellbar (Blendenöffnungen, Winkel, ROI,zu untersuchendes Objekt sowie dessen Position) • Simulation von Messungen (mit d-Werten) • Durchführung von Simulationsläufen für verschiedene Blendensysteme und Beugungswinkel • Ermittlung optimaler Parametereinstellungen • entsprechende Konfiguration der Röntenbeugungsanlage • Ergebnisse der besten Simulationen (Spektren) Beugungswinkel: 38mrad Primäre Beugungsblenden: 1te Konfiguration: oben:0.4 mm, unten 0.25 mm 2te Konfiguration oben:1.5 mm, unten:1.25 mm Sekundäre Beugungsblenden: gleiche Konfig. oben: 4.7/5.6 mm, unten 12.9/14 mm PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 14

12. Messapparatur Optimierung (II) – xSim2001 v1.0 Screenshot • Darstellung simulierter Beugungsmessungen PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 15

13. Messapparatur – Messung (I) • Im Folgenden führten wir folgende Messungen durch: • 1. Messung: Ca-DPA mit kleinen Blenden + Transmission • 2. Messung: Ca-DPA mit großen Blenden + Transmission • 3. Messung: Sporen + Untergrund + Transmission PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 16

14. Messapparatur – Messung (II) • Ca-DPA Messung bei einem Winkel von 38mrad • Primärblenden:0.4mm / 0.25mm 1.5mm / 1.25mm PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 17

15. Messapparatur – Messung (III) • Sporen Messung bei einem Winkel von 38mrad • Primärblenden: 1.5mm / 1.25mmGemessene Spektren Divisionsspektrum PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 18

16. Auswertung – Normierung (I) • Division der Spektren, dann: • Fit der Peaks und Bestimmung/Vergleich der d-Werte • Untersuchung der Peakverbreiterung • Rekonstruktion PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 19

17. Auswertung – Netzebenen (II) • Vergleich der d-Werte zu Referenz [1] • Gute Übereinstimmung bei gleichen Anlagenparametern(kleine Blendenkonfiguration) • Verschiebung zu größeren d-Werten bei größeren Blenden(wg. Asymmetrie) PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 20

18. Auswertung – Blendenverbreiterung (III) • Aus der Winkelunsicherheit ΔΘ folgt eine Peakverbreiterung • Bragg-Gleichung liefert Energie … und daher Unsicherheit • Winkelunsicherheit nicht exakt bekannt • Experimentelle Verbreiterungenaus Gauß-Fits werden gewichtetgefittet („Verbreiterungsfaktoren“) • Abschätzung zeigt Überein-stimmung mit Größenordnung PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 21

19. Auswertung – Faltung (I) • Diskrete Faltung: • Problem: Nicht-konstanter Faltungskern verursacht im diskreten Fall „stark nicht-stetige“ Resultate • Blendenverbreiterung ΔE ~ E • Korngrößenänderung ΔE ~ 1/E • Abhilfe: Spline-Interpolation “zwischen zwei Kernen“ • Realisierung eines Algorithmus mit Matlab PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 22

20. Auswertung – Faltung (II) • Verwendung von Gaußkernen • Beispiel: Faltung von zwei Peaks mit lin. Verbreiterung ~ E PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 23

21. Auswertung – Faltung (III) • Rekonstruktion der gemessenen Ca-DPA-Spektren aus • d-Werten • Intensitäten • Verbreiterungsfaktoren PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 24

22. Auswertung – Faltung (IV) • Vergleich mit Simulation • Fehlende d-Werte werden bestätigt • Ähnlich Resultate, jedoch geringere Übereinstimmung PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 25

23. Auswertung – Faltung (V) • Ziel: Rekonstruktion des relevanten Bereich des Sporenspektrums aus Ca-DPA Spektrum • Algorithmische Minimierungder Differenzspektren inMaximumnorm • Annahmen • Generelle Verschmierung durchbiologische Probe(Grundverbreiterung) • Korngrößenverkleinerung deskristallinen Ca-DPA(Scherrerverbreiterung) PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 26

24. Auswertung – Faltung (VI) • Faltung von Ca-DPA Spektrum mit Verbreiterungskern • Aufgabe:Suche Verbreiterung, s.d. Abstände der beidenMaxima im Sporenspektrum mit denen im gefalteten Spektrum etwa übereinstimmen: PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 27

25. Auswertung – Korngröße (I) • Problem: Linker Peak weist zuwenig Intensität auf • Möglicher Grund: Korngrößenverkleinerung • Scherrer – Formel • Hier ist Δ die Peakverbreiterung, K der Scherrer-Formfaktor und L die Korngröße • Kleine Kristallite Größere Verbreiterung • Idee: Faltung des verbreiterten Spektrums mit einem gemäß 1/E verbreiternden Kerns. PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 28

26. Auswertung – Korngröße (II) • 1/E Kernverhalten kann ersten Peak vergrößern • Recht gute Übereinstimmung, Abweichung 8-10 % • Aber: Zu ungenau – Verbreiterung korrespondiert zu Korngrößen im Bereich ~1nm nach Scherrer PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 29

27. Fazit - Ist Ca-DPA in den Sporen nachweisbar...? • Zusammenfassung • Vormessung & Simulationwichtige Voraussetzung zur Parameter-Optimierung • Messung und Auswertung der aufgenommenen Spektren • Bestimmung der d-Werte, • Intensitäten • Halbwertsbreiten • Matlab-Analyse zur RekonstruktionSporen-Spektrums aus Ca-DPA-Spektrum mittels Faltung • Fazit / Ausblick • Spektrum konnte mittels Faltung rekonstruiert werden • Ursachen der Verbreiterung nicht gänzlich geklärt • Bilden eines Entfaltungskern: Sporen Ca-DPA • Kurze Messzeiten & schnelle Algorithmen zur Auswertung für spätere kommerzielle Anwendung notwendig PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 30

28. Quellen „Möglichkeiten zur Identifikation von Bakterien-Endosporen durch kohärente Röntgenstreuung“Diplomarbeit 2004DANIELA FELLINGER „The Crystal Structure of Calcium Dipieolinate Trihydrate (A Bacterial Spore Metabolite)“Acta Cryst. (1968). B 24, 571GERALD STRAHS AND RICHARD E. DICKERSON „Quantitative simulation of coherent X-ray scatter measurements on bulk objects“Journal of X-Ray Science and Technology 12 (2004) 83-96H. Bomsdorf, T. Müller, H. Strecker Wikipedia Commons PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 31

29. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit & Interesse PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 32