Leishmanioses

1. Leishmanioses

2. Leishmania sp. Classificação: Filo Sarcomastigophora Sub-filo Mastigophora Ordem Kinetoplastida Família Trypanosomatidae Gênero Leishmania Características gerais Protozoário flagelado Dois hospedeiros obrigatórios (igual ao T. cruzi /brucei ), heteroxénico Habitat: - Vetor: lúmen do trato digestivo (Subgenus Leishmania: intestino anterior/médio) (Subgenus Viannia: intestino anterior/médio/posterior) - Hospedeiro vertebrado: células do sistema mononuclear fagocitário (SMF), principalmente macrófagos

3. Leishmaniose: Aspectos históricos e sociais • Doença benigna ou mortal, na forma cutânea deixa cicatrizes grandes (“botão do oriente”), doença conhecida na America do Sul antes da chegada dos espanhóis • Agente etiológico descrito primeiramente por Borovsky em 1898 em um paciente no Usbequistão • Leishman e Donovan (1903) descreveram o parasita independente- mente em um caso de calazar da Índia • Ross (quem descreveu o cíclo de vida do plasmódio) batizou o parasita em 1903 Leishmania donovani, e Wright denominou um parasita vindo de uma criança da Armênia (forma cutânea) Leishmania tropica

4. Em 1909, Lindenberg, Paranhos & Carini demonstraram a presença dos parasitos em lesões de pacientes brasileiros, Gaspar Vianna denominou-os Leishmania braziliensis e detectou em 1912 a ação curativa do tártaro emético • Em 1987, Lainson e Shaw sugerem um novo subgênero de Leishmania: o subgênero Viannia, que inclui espécies das Americas

5. Polimórfico: Promastigota • Paramastigota • Promastigota metacíclico • Amastigota • Reprodução por divisão binária Inseto Hospedeiro mamífero Macrófago com amastigotas

6. Organização celular • Genoma com 36 chromossomos (L. major, Projeto genoma • completo), 8305 genes identificados (4/2005) • - K(C)inetoplasto, trans-splicing

7. Ciclo de vida

8. Formas promastigotas metacíclicasregurgitadas por mosquitos são depositadas na dermis,onde são fagocitados por macrófagos • Vetores (Diptera, Phlebotomidae: Lutzomiya, Phlebotomus), no • território brasileiro: Lutzomiya longipalpis, L. wellcomei e outros

9. Promastigotas dentro do fagolisossomo se transformam em amastigotas, que se multiplicam no macrófago. A célula hospedeira é rompida liberando amastigotas que são fagocitados por outros macrófagos M

10. M Macrófagos infectados com Leishmanias do subgênero Viannia (espécies das Américas) contém menos parasitas em vários vacúolos parasitóforos (ajuda no diagnóstico por microscopia) M Subgênero Leishmania Subgênero Viannia

11. M Macrófagos infectados são ingeridos por Lutzomiya

12. Após ingestão, amastigotas se transformam em promastigotas e se multiplicam dentro de uma membrana formada pelo vetor Trato digestivo Membrana peritrófica

13. Promastigotas se desenvolvem para paramastigotas que aderem em pontos diferentes no trato digestivo (critério da localização: subgenênero de Leishmania), a proliferação é estimulada se a fêmea ingere sucos vegetais

14. Após 3-5 dias, promastigotas metacíclicos migram ativamente para partes anteriores do tubo digestivo Assim, o parasita parece interferir ativamente com a capacidade de ingestão do hospedeiro mosquito! A saliva do flebotomíneo é muito importante para a infecciosidade da Leishmania Somente promastigotas metacíclicos são infecciosos para os hospedeiro vertebrado!

15. Patogenia e interação parasita-hospedeiro Após deposição de promastigotas na pele complemento liga à superfície do parasita mas a clivagem de C3b em iC3b não permite ligação do complexo lítico C3b iC3b

16. Proteína gp63 cliva o fator do complemento C3b para iC3b. Complemento ajuda na aderência das promastigotas nos macrófagos (receptor principal CR3). Interação de LPGs e gp63 com fibronectina também ocorre. Esta via de internalização não leva a produção radicais de oxigênio ou NO (“silent entry”) Receptor de complemento CR1 CR3 (Mac1) M iC3b

17. M Porque uma célula profissional do sistema fagocitário não consegue eliminar um parasita dentro do fagossomo? 1. A sinalização para ativação do macrófago está impedido por ação de LPG: Tradução de sinais, mobilização de cálcio, ativação de Proteina kinase C.

18. IFN  2. Indução de resposta disfuncional: inibição da produção de radicais de OH e NO Falha na apresentação em MHC2 após estimulação com IFN  Fosfoglicanos bloqueiam produção de IL-12 ? M

19. Secreção de EF1 da Leishmania para o citossol M Ativação de SHP-1 (uma Phosphotirosina fosfatase) 3. Proteina tirosina quinases também são bloqueados Inativação da Fosfotirosinaquinase: reação atenuada a IFN

20. A espécie infectante é importante para o fenótipo da patologia desenvolvida em indivíduos imunocompetentes (Leishmanias que ocorrem no Brasil) A expressão diferencial ou presença/ausência de genes provavelmente causa as diferenças nas patologias observadas

21. Os diferentes tipos de Leishmaniose na clínica • Visceral ou Calazar (L. donovani, L. infantum, no Brasil • causada por L. chagasi ): • - Enfermidade crônica • - Caracterizada por: • febre irregular e de longa duração • hepatoesplenomegalia • linfoadenopatia • Anemia com leucopenia • Hipergamaglobulinemia • Emagrecimento • Edema • Caquexia e morte se não for tratado, dentro de 2 anos

22. - Formas clínicas calazar:assintomática, oligossintomática, aguda e crônica

23. Tegumentaria: • a) Cutânea: • - Infecção confinada na derme, com epidermis ulcerada • - Velho mundo, L. tropica, L. major e L. aethiopica • - Novo mundo, leishmanias do complexo mexicana e braziliensis • - noBrasil: L. braziliensis, L. guyanensis • L. chagasi, L. lainsoni

24. Leishmaniose cutânea (“oriental sore” “botão do oriente”, “Úlcera de Bauru”

25. b) Muco-cutânea: - Infecção na derme (ulceras), invasão de mucosa e destruição da cartilagem - No novo mundo: L. braziliensis, L. guyanensis, L. mexicana (“espundia”), no Sudão/Etiópia L. major, L. tropica

28. c) Cutânea difusa: - Infecção confinada na derme, formando nódulos não ulcerados. Disseminação por todo o corpo - Associado a deficiência imunológica do paciente - Novo mundo, L. pifanoi,L. amazonensis - Velho mundo, L. aethiopica

29. M Responsável pela patologia é o estado imunológico do hospedeiro predominância de resposta celular (Th1) leva a imunidade e cura, resposta humoral (Th2) leva às formas crônicas IFN, TNF, IL-2 Th1 I MHC II Células T helper Th2 IL 4-6, IL-10, TGF indução da atividade policlonal de células B

30. No modelo L. major e camundongo Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-76:115-30

31. Quais são os motivos para tanta diversidade da patologia da infecção? - Na forma cutânea, há uma inflamação ativa. Células dentríticas apresentam antígenos em MHC2 e expressam ICAM-1. Ativação de Th1 por IFN e TNF resulta no recrutamento de células T CD8+ para a região infectada. Cura. - Na forma mucocutânea, pouco envolvimento ou destruição de células Langerhans, mas há apresentação em MHC2 e células com ICAM1, mas TH1 e Th2 estão ativados. IL10 promove o decréscimo da apresentação de antígenos e de produção de IFN. Pode ter hiperprodução de IL1, TNF e ICAM1, resultado é um estado pró-inflamatório e destruição sucessiva de tecido.

32. -Na forma visceral, não há resposta Th1 e nem aumento de atividade Th2. Fatores parecem ser do próprio macrófago infectado. Possivelmente, lipofosfoglicanos da Leishmania estão envolvidos.

33. Diagnóstico: As Leishmanias são vistas nas formas amastigotas

34. Diagnóstico Leishmaniose Tegumentaria • Clínico • Caraterísticas da lesão e dados epidemiológicos • Laboratorial • - Exame direto de esfregaços corados (Romanowsky, Giemsa ou • Leishman) • - Exame histológico • - Cultura • - Inóculo em animais • - PCR (reação em cadeia da polimerase, permite a identificação da • espécie infectante) • Importante para exclusão de tuberculose cutânea, hanseníase, • infecções por fungos, úlcera tropical, neoplasmas

35. Diagnóstico Leishmaniose Tegumentaria • Imunológicos • - Teste de Montenegro (teste da resposta contra formas promastigostas mortas do parasita, resposta celular) • - Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) (resposta humoral) • - Hemaglutinação indireta

36. Diagnóstico Leishmaniose visceral (Calazar) • Clínico: sintomas • - Febre baixa recorrente, envolvimento linfohepático, • esplenomegalia, caquexia e dados epidemiológicos • Laboratorial: • 1. Exames Parasitológicos • a) Demonstração direta do parasita Esfregaços corados com Giemsa ou Leishman de: • - Material obtido por punção de medula óssea, fígado ou baço - Biopsia (menos eficiente ~ 50%)

37. - Fase aguda 80-90% de positividade - Fase sub-clínica 10% - Co-infectados com HIV recomendado exame de medula óssea - Aspirado esplênico 100 %, sangue periférica 30% b) Isolamento em cultivo in vitro Aspirado ou biopsia LIT, MEM, Schneider’s e Evans (Meio monofásico) a 26ºC Exame microscópico ( 2x semana/4 semanas)

38. c ) Isolamento em cultivo in vivo • Inoculação em animais • - Hamsters ou camundongos isogênicos (BALB/c) • - Cepas dermatotrópicas: pata ou tocinho dos animais • (positivo após 2 a 4 semanas) • - Cepas vicerotrópicas via intraperitoneal (positivo após 6 meses) • - Recomendado para o isolamento do parasita nas formas sub- clínicas • Xenodiagnóstico • - Flebótomos • - Usado em pacientes com AIDS portadores de Leishmaniose visceral

39. 2. Testes Imunológicos • a) Teste de Montenegro • b) Testes serológicos • Antígenos (parasitas inteiros, inativados) • - Reação de aglutinação direta • Cave: Reatividade cruzada com Chagas e tuberculose • Visualiza títulos até de 1:51.200 • Leishmaniose visceral título > 1:1.600 (sensibilidade 100%) no Brasil o título > 1:6.400 • c) Detecção do antigeno rK39 na urina

40. 3. Análise do DNA de material recolhido a)Por reação em cadeia da polimerase (PCR) Usa oligonucleotídeos espécie-específicos do DNA dos minicírculos do DNA do cinetoplasto 100% sensível e mais específico que sorologia b) Possibilita discriminação de espécies

41. Tratamento LeishmanioseTegumentaria • 1. Quimioterapia • Antimoniais • Tártaro emético • antimonial trivalente • Glucantime(antimoniato de N-metil-glucamina) • antimonial pentavalente • Pentostan (estibogluconato de sodio) • - antimonial pentavalente • - inibe glicolise e síntese • - administração intramuscular ou • intravenosa absorçãorápida

42. Dihydroxyacetone Phosphate • - Excreção rápida e pela urina, vida media 24 horas • - Droga recomendada para os três tipos de leishmaniose Glucose Glucose 6-phosphate Pentose Fructose 6-phosphate Phosphate Pathway Fructose 1,6-bisphosphate Glyceraldehyde 3-phosphate 1,3-Diphosphoglycerate 3-Phosphoglycerate 2- Phosphoglycerate Phophoenolpyruvate * PK Antimoniais Pyruvate Acetyl- CoA Krebs Cycle

43. Pentamidina • - liga ao DNA, inibindo a replicação • - Inibe a dihidrofolate reductase, interfere • com o metabolismo de poliaminas • - Administração intramuscular • - Excretado lentamente, é seqüestrado nos • tecidos (tem uso profilático contra tripanossomiase) • - Produz hipo- ou hiperglicemia

44. Anfotericina B • - lipofílico • - Liga a esterois (ergosterol) da membrana formando poros. Funciona como um ionóforo • - 2-5% excretado na urina • - 90% ligado a proteínas do plasma • - Meia vida 18 horas

45. Continuação tratamento LeishmanioseTegumentaria 2. Imunoterapia Leishvacin seriado Leishvacin associado ao BCG Leishvacin seriado associado ao BCG Leishvacin associado ao BCG com Glucantime  Interferon gamma humano recombinante (Rhifn-g) anti-IL10-receptor

46. Tratamento Leishmaniose visceral • 1. Quimioterapia • Antimoniais • Tártaro emético • Glucantime • Pentamidina • Anfotericina B • Miltefosin 2. Imunoterapia Interferon gamma recombinante (Rhifn-g)

47. Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-76:115-30

48. Medidas de prevenção • Identificação de focos de Leishmania (animais • infectados em proximidade a domicílios: • silvestres e domésticos: erradicação • Imunização em massa de cachorros (Leishvaccin) • Vacinas para seres humanos? • Componentes da saliva de Phlebotomíneos como vacina?

49. Ecologia dos Phlebotomíneos: Desenvolvimento e comportamento • 40-70 ovos por desova, agrupados em lugares humidos, eclodem depois 6-17 dias • Larvas se nutrem de matéria orgânica por mais 15-70 dias, depois pupa (7-14 dias) • Adultos são ativos no crepúsculo ou a noite, durante o dia permanecem em lugares tranquilos: tocas, arvores ocas, currais, moradias • Não sobrevivem bem em ambientes que não tenham pelo menos um mes T acima de 20°C