CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS MEDICINALES Dra. Lucy A. Ibáñez,Mg,Dr Lima-Perú 2008

1. USAL CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS MEDICINALES Dra. Lucy A. Ibáñez,Mg,Dr Lima-Perú 2008

2. INVESTIGACION EN PLANTAS MEDICINALES La Investigación etnobotánica y etnofarmacológica de las especies vegetales para su posible utilizaciòn fitoterapèutica, exige un delicado protocolo de trabajo que incluye toda la escala de pruebas y ensayos que van desde la selección de una determinada planta de acuerdo a ciertos criterios hasta una exhaustiva gama de ensayos farmacològicos, químicos fitoquímicos, toxicológicos y clínicos. Manual de Técnicas Experimentales . Proyecto X.10 . CYTED

4. ¿Ensayos Clínicos en Plantas Medicinales? ESTUDIOS PRE-CLÍNICOS ESTUDIOS CLINICOS A U T O R I D A D R E G U L A D O R A ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS ESTUDIOS FASE I ESTUDIOS FASE II ESTUDIOS FARMACÓLOGICOS ESTUDIOS FASE III ESTUDIOS QUIMICO-FARMACÉUTICOS AUTORIDAD REGULADORA ESTUDIOS FASE IV ESTUDIOS ETNOBÓTANICOS, AGRONÓMICOS

5. FASES DE ESTUDIO DE UN NUEVO MEDICAMENTO Selección y estandarización del material activo Estudos pre-clínicos FASE II Estudos pre-clínicos FASE I • Eficacia • Efectos colaterales • Toxicologia aguda • Doses repetidas • Farmacocinética • Toxicologia especial Test clínicos FASE I Test clínicos FASE II Test clínicos FASE IV Test clínicos FASE III • VOLUNTÁRIOS • limites de dosis • farmacocinética • efectos inesperados • PACIENTES • eficacia • MULTICÉNTRICO • efectos colaterales • interacciones • ventajas • limitaciones • USO GENERAL • vigilancia médica

6. FARMACOLOGIA TOXICOLOGIA ENSAYOS CLÍNICOS(FARMACOLOGOS;,QUIMICOS FARMACEUTICOS; MEDICOS; ETC) PLANTA CONTROL DE CALIDAD FITOMEDICAMENTOS COMERCIALIZACION, EXPORTACION (EMPRESARIOS, EXPORTADORES, COMUNIDADES ANDINAS, AMAZONICAS, ETC) INVESTIGACION EN PLANTAS MEDICINALES (EQUIPO MULTIDISCIPLINARIO) CULTIVO (ING. FORESTAL, ING. AGRONOMO, ETC) PATENTES SÍNTESIS QUÍMICA COMBINATORIAL FARMACOLOGÍA MOLECULAR QUÍMICA ORGÁNICA(QUIMICOS; INGENIEROS QUÎMICOS, FARMACÉUTICOS, ETC) PROCESO DE VALIDACIÓN BOTÁNICA (BOTANICOS, TAXONOMOS FARMACEUTICOS; BIOLOGOS, ETC) ETNOFARMACOLOGIA (FARMACÓLOGOS; ANTROPÓLOGOS;FARMACÉUTICOS; BIOLOGOS;MEDICOS, ETC).

7. VALIDACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES Test in vitro, preclínicos Y clínicos PLANTA Perfil farmacológico Análisis toxicológico EFICACIA SEGURIDAD PLANTA MEDICINAL Síntesis química de derivados activos NUEVOS MEDICAMENTOS Fracciones purificadas Principios activos aislados e identificados Extracto total de la planta

8. INCIDENCIA DE ENFERMEDADES DE CRONICO DEGENERATIVAS Numerosos estudios en nutrición humana demuestran una estrecha correlación entre el consumo de frutas y verduras y la menor incidencia de enfermedades crónico degenerativas debido a su bajo contenido en calorías, colesterol y a la presencia de vitaminas, fibras, antioxidantes naturales y minerales. Así mismo el estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas, como arterioesclerosis, artritis, demencia, cáncer, etc; es por ello que el uso de antioxidantes en farmacología es estudiado de forma intensiva, particularmente en el tratamiento de accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas.

9. INCIDENCIA DE ENFERMEDADES DE CRONICO DEGENERATIVAS El oxígeno es esencial para la mayoría de los organismos que viven bajo condiciones aerobicas. Este es utilizado por la célula , la cual posee diversos sistemas que producen radicales libres de oxígeno(RLO). Frente al poder agresivo de estos RLO, la célula posee un arsenal defensivo de mecanismos neutralizantes formado por enzimas y compuestos que evitan la formación incontrolada y excesiva de RLO y producen la neutralización, eliminación y bloqueo de su actividad en cadena

10. INCIDENCIA DE ENFERMEDADES DE CRONICO DEGENERATIVAS La enzima superóxido dismutasa remueve el anión superóxido (O2º) convirtiéndolo en H2O2, el cual es transformado por la enzimas catalasa y Glutatión peroxidasa en agua (H2O) . Así mismo también posee moléculas que remueven los radicales libres por reacción directa (no catalítica) tales como: el glutation reducido, los tocoferoles (vitamina E) y el ácido ascórbico (Vitamina C).

11. Así mientras que niveles moderados de RLO constituyen y modulan vías fisiológicas de funciones celulares, incluyendo señalización en cascadas y el control de la expresión génica transcripcional y post-transcripcional, el estrés oxidativo severo induce daño celular que puede conducir a apoptosis o a la necrosis. • Por tanto el estrés oxidativo se deriva de la falta de equilibrio entre los mecanismos de defensa antioxidante y los fenómenos favorecederos de la oxidación.

12. PROCESOS OXIDATIVOS • Dos fenómenos muy importantes en nuestra vida son procesos oxidativos: la combustión y la respiración. Ambos se asemejan, ya que son procesos a través de los cuales sustratos combustibles se transforman en energía consumiéndose oxígeno y liberándose agua y dióxido de carbono. • Así, la combustión, es un proceso oxidativo en el cual un combustible se transforma en energía en forma de luz y calor, produciéndose además dióxido de carbono (CO2) y agua. Pero si el proceso no es perfecto, la oxidación no es total y produce contaminantes, como el monóxido de carbono.

13. En la respiración ocurre lo mismo: La glucosa y ácidos grasos - se transforman en energía. Esta transformación se realiza al interior de la célula, en la mitocondria y exactamente, se produce ATP, la molécula clave para la síntesis de los componentes celulares y para la mayoría de los procesos celulares, y que se conoce también como la "moneda" energética de la célula. • En la respiración se consume oxígeno, se genera ATP, y quedan como residuos dióxido de carbono y agua. Pero, este proceso no es perfecto ya que se producen también otras moléculas contaminantes, las Especies Reactivas del Oxígeno (EROs). Entre el 1 y 3 % del oxígeno que respiran nuestras células al oxidar sus sustratos se transforma en EROs, que, o bien son radicales libres, o llevan a su formación.

14. ESPECIES OXIGENO REACTIVAS (ROS) Por causas ambientales (radiación), así como por la ingesta de algún contaminante o incluso como consecuencia de nuestro propio metabolismo, surgen algunas moléculas que nos pueden provocar daño. A estas se les conoce como especies oxigeno reactivas (ROS), que se asocian a enfermedades como cáncer, problemas cardiacos o al natural envejecimiento humano. Entre los problemas que originan figuran: destrucción de paredes celulares, inactivación de enzimas, debilitamiento de la capacidad defensiva, alteración del sistema inmunológico e incluso daño del material genético .

15. RADICALES LIBRES Además la radiación cósmica y la radiación electromagnética de baja longitud de onda (por ejemplo los rayos gama) pueden dividir el agua en el cuerpo para generar el radical hidroxilo, OH▪. Este radical débilmente reactivo una vez producido ataca a cualquier cosa que este cerca, siendo su vida media extremadamente pequeña y reaccionando en su punto de formación dejando tras de si una secuela de reacciones en cadena de radicales libres en propagación.

16. SUPLEMENTACION NUTRICIONAL Es así que un estudio realizado en China demostró la eficacia de una “suplementación nutricional" con β-caroteno, vitamina E y Selenio sobre la mortalidad total y por cáncer (especialmente carcinoma de esófago en una población deficitaria). Sin embargo un estudio Finlandés realizado sobre una población de alto riesgo (fumadores importantes) mostró que la suplementación con dosis elevadas de β -caroteno aumentaba el riesgo de padecer un carcinoma de pulmón. Es muy importante que una dieta diaria debe proveer cantidades adecuadas de nutrientes esenciales “naturales” para el mantenimiento de una salud óptima. Estos antioxidantes naturales se encuentran presentes en prácticamente todas las plantas, microorganismos, hongos e incluso en los tejidos animales.

17. TENDENCIAS MUNDIALES DE LA ALIMENTACION Las tendencias mundiales de la alimentación en los últimos años indican un interés acentuado de los consumidores hacia ciertos alimentos que además de contener nutrientes contengan sustancias fisiológicamente activas que cumplan, al igual que los nutrientes esenciales, una función de beneficio en la reducción de ciertas enfermedades.

18. TENDENCIAS MUNDIALES DE LA ALIMENTACION A estos alimentos se les ha denominado “alimentos funcionales” y se vienen realizando la identificación de ciertos principios activos, a fin de evaluar su seguridad y las dosis respectivas a utilizar, estableciéndose en la mayoría de casos marcadores analíticos, marcadores farmacológicos, realizándose además ensayos clínicos controlados a doble ciego y la demostración de sus efectos bioquímicos, fisiológicos, farmacológicos y toxicológicos.

19. ALIMENTOS FUNCIONALES El término Alimento Funcional fue propuesto por primera vez en Japón en la década de los 80’s con la publicación de la reglamentación para los "Alimentos para uso específico de salud" ("Foods for specified health use" o FOSHU). Aunque el término alimentos funcionales no es una categoría de alimento legalmente reconocida por la Administración de alimentos y Drogas (FDA) de los Estados Unidos, sin embargo se han dado recientemente algunos cambios legislativos acerca de la información que deben contener las etiquetas de los productos relacionados con beneficios funcionales de los alimentos.

20. REGULACIONES Las regulaciones de la NLEA (Ley de Etiquetado y Regulación Nutricional) y de la DSHEA (Ley de Suplementos Dietéticos Salud y Educación) se encaminan a preparar el camino legal en que se debe fundamentar el uso de estos productos. La posición oficial de la U.S. Food & Drugs Administration (FDA) es: "Las sustancias específicas de los alimentos pueden favorecer la salud como parte de una dieta variada".

21. Antioxidantes • Se define como cualquier sustancia que, a bajas concentraciones en comparación con el sustrato oxidable, retrasa o inhibe significativamente la oxidación de dicho sustrato. Para lograrlo los antioxidantees entregan un electron a los radicales libres, con lo cual los desactivan, apagando el proceso de oxidaciòn y transformandose ellos en radicales libres inactivos o poco reactivos. • La importancia de un antioxidante depende de su concentración, del medio donde actúa y de su habilidad para interaccionar con sistemas regeneradores. • Ciertas enfermedades como la arterioesclerosis, degeneraciones ligadas al envejecimiento y el cáncer, podrían estar unidas al fenómeno de la oxidación celular mediada por radicales libres.

22. ENFERMEDADES CRONICODEGENERATIVAS EL ENVEJECIMIENTO

23. .

24. OXIDACION DE MOLECULAS BIOLOGICAS La oxidación de las moléculas biológicas, membranas y tejidos es inducida por el oxigeno activo y mediada por radicales libres, lo cual esta relacionado con un aumento en la incidencia de enfermedades digestivas en los seres humanos. El metabolismo oxidativo, proceso biológico normal, es capaz de generar radicales libres oxigenados, altamente reactivos. Estas especies con oxígenos activos incluyen el radical superóxido (O2º), el peróxido de hidrógeno (H2O2), el radical óxido nítrico (NO▪) y el oxígeno singulete (1O2).

25. Sustancias propias del organismo, enzimas antioxidantes • Tambièn cierta parte de los superóxidos son producidos por accidentes químicos en los que muchas moléculas del cuerpo reaccionan directamente con el Oxigeno para producir súperóxido. Ejemplos de ello incluyen las catecolaminas, tetrahidrofolatos y algunos componentes de la cadena mitocondrial y otras cadenas de transporte de electrones. • Esta producción de superóxido es inevitable. Además cierta cantidad de súper óxido se produce deliberadamente por ejemplo los fagocitos activados (neutrófilos, monocitos, macrófagos, eosinófilos) dan lugar a grandes cantidades superóxido como parte del mecanismo a través del cual exterminan a los organismos extraños durante las inflamaciones crónicas este mecanismo protector normal puede afectarse.

26. Sistemas antioxidantes del organismo • . ANTIOXIDANTES ENZIMATICOS. INTRACELULAR. ENDOGENOS Catalasa Glutation peroxidasa Gutation reductasa Superoxido dismutasa Complejo reparador de ADN • ANTIOXIDANTES NO ENZIMATICOS. • EXTRACELULAR. ENDOGENOS DIETARIOS EXOGEBNOS • Glutation B Caroteno • Urato Vit C y E • Ubiquinol Polifenoles • Poteínas plasmáticas Flavonoides • Químicos sintéticos

27. Sustancias propias del organismo, enzimas antioxidantes Además de las enzimas glutatión peroxidasa, catalasa y superóxido dismutasa, hay otras sustancias antioxidantes como la coenzima Q-10, que ayuda a las enzimas a realizar su función, y participa en numerosos procesos corporales. Se ha comprobado una gran similitud entre las propiedades antioxidantes de la vitamina E y las de la coenzima Q-10, que juega un muy importante papel en la generación de energía celular, y a su vez es un estimulante inmune, mejora la circulación y ayuda a proteger el sistema cardiovascular.

28. Sustancias propias del organismo, enzimas antioxidantes Entre los principales antioxidantes dietarios esta la vitamina E que se ha demostrado posee actividad antioxidante in vivo. La vitamina C in vitro regenera a la vitamina E, lo que probablemente ocurra tambien in vivo. Los carotenoides estàn presentes en zanahorias , berros, espinacas, tomates , mangos y damascos. Los polifenoles son un grupo de compuestos presentes en la naturaleza, en su mayoría potentes antioxidantes necesarios para el funcionamiento de las células vegetales, que se encuentran en frutas y verduras, principalmente manzanas y cebollas y en bebidas como el té y el vino.

29. Los principales polifenoles identificados en la dieta son àcidos fenólicos, derivados de tirosina, estilbenos, flavonoides y compuestos poliméricos como los taninos. En estudios in vitro, muchos polifenoles naturales son mejores antioxidantes que la vit C y E, siendo la quercetina la sustancia más abundante. Los citroflavonoides presentes en algunos cítricos, como el hesperidósido y el rutósido, son eficaces antioxidantes.

30. Moléculas con actividad antioxidante Flavonoides

31. Investigación de plantascon actividad antioxidante

32. OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL(MV) El MV que serà utilizado para la investigación se debe recolectar de acuerdo con cada especie, la época de recolección, la parte que es utilizada, la naturaleza, cantidad y tipo de principio activo, los mismos que varían considerablemente de acuerdo a la familia, género y especie de cada planta medicinal y se debe proceder de forma rigurosa a su correcta identificación, posterior preservación, conservación y preparación.

33. Plantas peruanas nativas e introducidas evaluadas

34. EXTRACCION DEL MATERIAL VEGETAL • Una vez seleccionada y recolectada la especie que se quiere estudiar se dispondra de una cantidad apropiada de material vegetal seco que puede triturarse en mayor o menor grado,según el caso y posteriormente someterse a la acción del disolvente oportuno en las condiciones y con la duración adecuadas para conseguir la extracción más completa posible de las sustancias activas en el MV.

35. SCREENING FITOQUIMICO • El objetivo de la primera extracción se centra en la obtención de una pequeña porción de extracto, en cantidad suficiente que permita por un lado, la realización de los bioensayos preliminares programados , encaminados a demostrar la presencia de sustancias bioactivas en él y por otro disponer de materia para obtener cromatogramas (CF) en diversas condiciones de elución, espectros de infrarojo(IR) y de Resonancia Magnetica Nuclear de protón (RMN), que sirvan para caracterizar suficientemente el extracto y proporcionar información sobre su probable composición. Manual de Técnicas Experimentales . Proyecto X.10 . CYTED

36. CARACTERIZACION PRELIMINAR DE LOS EXTRACTOS Para conseguir el aislamiento y purificaciòn de los principios activos , se recomienda utilizar algunas técnicas fisicoquímicas e instrumentales que puedan informar sobre la naturaleza y composición de los extractos y fracciones que se estén analizando y puedan permitir detectar la presencia de algunos tipos de metabolitos, alcaloides, flavonoide, esteroides, saponinas. Como herramienta fitoquímica se utiliza un conjunto de técnicas muy bien establecidas, que están basadas en reacciones coloreadas, selectivas o específicas y que mediante reactivos de diverso tipo, aplicados generalmente de forma directa sobre el extracto o sus fracciones o sobre placas cromatográficas desarrolladas, proporcionan información sobre la presencia de distintos grupos de metabolitos. Manual de Técnicas Experimentales .

37. OXIDACION DE MOLECULAS BIOLOGICAS Otro grupo de herramientas muy útiles se basan en la aplicación de técnicas espectróscopicas generalmente disponible. Es conveniente obtener espectros IR (neto) y RMN1H (Preferentemente en CDCl3 o DMSO-d6) del extracto o la fracción, para tratar de detectar y estimar particularmente la presencia y la proporción de componentes lineales y otros tipos de metabolitos secundarios definidos.

38. CARACTERIZACION PRELIMINAR DE LOS EXTRACTOS La estimación de la presencia de componentes lineales se consigue directamente mediante observación simple de la intensidad y proporción de las absorciones hacia 720 cm-1(IR) y 1,25 ppm (RMN 1H). La estimación de componentes funcionalizados se puede llevar a cabo tambien mediante la observación del espectro de IR, a través de las absorvaciones que aparezcan en las regiones de 3,500-3000 cm-1(funciones NH y OH, olefinas y sistemas aromáticos), 1800-1500 cm-1 (carbonilos, carboxilos e insaturaciones ) y 1100-800 cm-1 (éteres e insaturaciones); complementandola con la observación del espectro de RMN1H , en las zonas 13-8 ppm (H puente, aldehidos, amidas), 8-6 ppm (aromáticos y olefínicos conjugados)), 6-3 ppm (olefínicos, alcoholes, ésteres, grupos metoxilo, azúcares) y 3-0,5 (metilos) ppm. Manual de Técnicas Experimentales . Proyecto X.10 . CYTED (pag 37)

39. VALIDACION EXPERIMENTAL • TamizajeIn vitro (céluas , órganos aislados) / In vivo: preclínica (animales) y clínica (humanos) antiinflamatoria, antitumoral, antiviral espasmolítica, analgésica, diurética, hipoglicémica, sedante,antioxidante, antiinfecciosa, cicatrizante, etc. • Extracción fraccionada ( > ó < polaridad) • Fraccionamiento dirigido. • Elucidación estructural: a) Universidad de Salamanca. (Departamento de Química Farmacéutica Dr. Arturo San Feliciano) b) Universidad Autónoma de Mexico (Instituto de Química. Dr. Ricardo Reyes Chilpa).

40. Plantas con acciónantioxidante

41. Aunque el rutósido es relativamente frecuente en la naturaleza, solo un pequeño número de plantas lo contienen en cantidad suficiente para permitir su extracción industrial. Se obtiene fundamentalmente a partir de la sófora (Sophora japonica L., Fabaceae), el trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum Moench., Fagopyrum tataricum [L.] Gaertn., Polygonaceae), Eucalyptus macrorrhyncha F. Muell., (Myrtaceae), y Dimorphandra spp. (Caesalpinaceae). Por su contenido en flavonoides, la hoja de ginkgo (Ginkgo biloba, Ginkgoaceae) , también llamado «árbol de los cuarenta escudos», es un excelente captador de radicales libres, lo que explica sus propiedades antioxidantes. Ginkgo biloba.

42. Otras plantas utilizadas como antioxidantes en productos cosméticos por su contenido en flavonoides son la manzanilla (Chamomilla recutita [L.] Rauschert, Asteraceae), la caléndula (Calendula officinalis L., Asteraceae) y el lúpulo (Humulus lupulus, Cannabaceae), si bien también se emplean flavonoides puros, como el hesperidósido y el rutósido. En el caso de la vid roja (Vitis vinifera L., Vitaceae)su utilización como antioxidante en la industria de los cosméticos se debe a la presencia de proantocianidoles. Vitis vinifera.

43. Los flavanolignanos presentes en el fruto del cardo María (Silybum marianum [L.] Gaertn., Asteraceae) inhiben la peroxidación lipídica de la membrana y actúan como captadores de radicales libres. • El principio activo mayoritario se conoce como silimarina, y está constituido por una mezcla de silibina, silicristina y silidianina. Silibina, silicristina, silidianina

44. OTROS PRODUCTOS CON ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Las ceramidas (esfingosinas N-aciladas por un ácido graso) y glicosilceramidas del trigo y del arroz, que constituyen una alternativa de las ceramidas animales; la industria cosmética las utiliza por su posible capacidad en la prevención o atenuación del envejecimiento cutáneo. Los ácidos grasos insaturados (aceites). Como ejemplo podemos citar el aceite de sésamo (semillas de Sesamum indicum, Pedaliaceae), el aceite de maíz (estigmas de Zea mays L., Gramineae), aceite de oliva (frutos de Olea europaea, Oleaceae) y aceite de cacahuete (semillas de Arachis hypogaea, Leguminosae).

45. Efecto antioxidante del hidroxitirosol procedente de la hoja de olivo (Olea europaea L) • El hidroxitirosol(2-(3,4-dihidroxifenil)etanol) es un compuesto fenólico presente en la hoja del olivo en forma libre y esterificada y que destaca del resto de polifenoles por sus múltiples actividades farmacológicas como antimicrobiano con actividad in vitro frente a bacterias gram + y gram -, inhibidor de la formación del leucotrieno B4 a nivel de la 5-lipooxigenasa implicadas en el proceso antiinflamatorio e inductor de apoptosis en células HL-60. La actividad antioxidante del hidroxitirosol es una de las más elevadas entre los polifenoles, siendo incluso superior a la de la Vitamina E. P. de la Fuente, P Chamorro, M. Moreno. M.A Poza. Revista de Fitoterapia 2004;4(2):PI-PF 139,140

46. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ANTI-ESTRES DE MACA

47. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS MEDICINALES PERUANAS NATIVAS E INTRODUCIDAS.Dr. Castañeda C. B.1, Q.F. Ramos LL. E. 2, Dra. Ibáñez V. L. 3 • RESUMEN Se evaluó la capacidad antioxidante de veintinueve extractos de las siguientes plantas medicinales: Cinnamomum zeylanicum “canela”, Calophyllum brasiliense “lagarto caspi”, Myrciaria dubia “camu camu”, Minthostachys mollis “muña”, Alchornea castaneifolia “hiporuro”, Smallanthus sonchifolius “yacón”, Lepidium peruvianum y Lepidium meyenii “maca”, por el método de la decoloración del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Los resultados obtenidos al evaluar la capacidad antioxidante a las concentraciones de 1 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL y 200 ug/mL fueron: canela (Extracto etanólico de la corteza) 97.59% a una concentración de 1 ug/mL, lagarto caspi (E. Metanólico de hojas) 99.76% a 50 ug/mL, camu camu (E. Metanólico del fruto) 98.09% a 50 ug/mL, muña (E. Acuoso de hojas) 92.41% a 50 ug/mL, hiporuro (E. Metanólico de hojas) 100.57% a 100 ug/mL, Lagarto (E. Acuoso de hojas) 110.56% a 100 ug/mL, Lepidium peruvianum (E. Acuoso de hipocótilo) 95.55% a 200 ug/mL y Lepidium meyenii (E. Metanólico de hipocótilo) 88.21% a 200 ug/mL, en comparación con el al ácido ascórbico (Vitamina C) que presentó una actividad antioxidante en promedio de 92.82%.

48. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL METODO DEL DPPH El Fundamento del método desarrollado por Brand-Willams et al , DPPH, consiste en que este radical tiene un electrón desapareado y es de color azul-violeta, decolorándose hacia amarillo pálido por la reacción de la presencia de una sustancia antioxidante siendo medida la absorbancia espectrofotométricamente a 517 nm. La diferencia de absorbancias permite obtener el porcentaje de captación de los radicales libres . 199 3.0

49. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Procedimiento: • 1. Se preparó 100 ml una solución de DPPH (2,2-difenil-1-picril hidrazilo) en metanol de 20 mg/L. • 2. Luego se preparó una solución metanólica de los extractos en una concentración de 300 ug/ml (Solución A) y de 600 ug/mL (Solución D) • 3. El Blanco se preparó con metanol agua 2:1 para ajustar el espectrofotómetro a cero. • 4. El Blanco de muestra se preparó con 0.75 mL de muestra (solución A) y 1.5 mL de metanol. • 5. Se preparó el patrón de referencia con 1.5 mL de DPPH y 0.75 mL de agua. • 6. Luego se procedió a preparar la muestra con 0.75 mL de solución A y 1.5 mL de DPPH, obteniéndose una concentración final de 100 ug/mL, dejándose x 5 min. Y se leyó a 517 nm en un espectrofotómetro. • 7. Se midió la absorbancia del patrón de referencia y del blanco de la muestra. • 8. Luego se diluyó la solución A con metanol en una proporción 1:2 (solución B) para obtener una concentración final de 50 ug/mL, y en una proporción de 1:10 (solución C) para obtener una concentración final de 1 ug/mL. • 9. Con las soluciones B, C y D se procedió igual a los puntos 6 y 7.

50. un Actividad Antioxidante DPPH (Forma radicalaria) DPPH (Forma reducida) Compuesto Compuesto oxidado N N H O N 2 NO 2 O N 2 Violeta Amarillo