Expositores : Castillo, Amalia; Ramallo, Martín; Laiseca, Julieta; Fassiano, Anabella

1. Expositores: Castillo, Amalia; Ramallo, Martín; Laiseca, Julieta; Fassiano, Anabella

2. The Immortal Strand Hypothesis: Segregation and Reconstruction Thomas A. Rando

3. Evidencia a favor de la hipótesis ImplicacionesBiológicas Algunas preguntas claves que han de ser ensayadas experimentalmente

4. Células Madre

5. Epidermis Capa basal de células madre

6. Intestino – Criptas de Lieberkühn

7. Células sanguíneas

8. Constante demanda sobre las células madre para dividirse. • Sitios de control en el ciclo celular • Detección y reparación de mutaciones Gran posibilidad de acumular mutaciones críticas que culminen en la formación de células tumorales.

9. La Hipótesis de la Hebra Inmortal Hugh John Cairns 1975

10. Hebra “Abuela” Hebra “Madre”

13. Stem Cell Vía de diferenciación Célula Madre Vía de proliferación

14. Hebra “Abuela” Hebra “Madre”

15. ¡ Inmortal ! Mutaciones

16. …ciertas implicaciones: • Exenta del acortamiento telomérico asociado con la replicación del ADN. • Se debe asumir que el intercambio y la recombinación entre cromátidas hermanas es particularmente bajo. • Excepción al mecanismo de identificación de células madres por “long term label-retaining”.

17. Consideraciones del mecanismo

18. Consideraciones del mecanismo ¿Cómo sabe la célula la edad de cada una de sus hebras de ADN? ? Simplemente…. …no se sabe.

19. Consideraciones del mecanismo ¿Cómo sabe la célula la edad de cada una de sus hebras de ADN? • Modificación covalente de las mismas hebras; Ej: Metilación. • Diferencias en la organización de la cromatina según su edad, a través de la asociación con histonas (presentan distribución no azarosa) o sus modificaciones, tales como la acetilación y la metilación. • Podrían estar implicados los mecanismos bioquímicos de establecimiento de los territorios cromosómicos.

20. Reconocimiento del cinetocoro por el huso mitótico y otras implicancias moleculares. Utilización de fármacos o modelos con genomas muy estudiados (Drosophilamelanogaster)

21. ¿Qué evidencias apoyan esta hipótesis? • Marcación de fibroblastos embrionarios con Timidina tritiada (H3-Td) (Lark et al., 1966) Marcación en las primeras etapas del desarrollo celular y posterior seguimiento de las sucesivas generaciones.

23. Se observó segregación asimétrica de las cadenas más antiguas, las cuales habían incorporado el marcador.

24. Marcación y seguimiento de las células del epitelio intestinal de ratón (Potten et al., 1978, 2002) Estudios a corto y largo plazo en la progenie de las Stem Cell, por marcación de las cadenas en el momento de formación de las Stem Cell.

25. Estudios de marcación de las cadenas parentales con H3-Td y Bromodeoxiuridina (BrdU) (Potten et al., 2002). Las células marcadas con H3-Td son luego marcadas con un pulso de BrdU). En un primer momento, todas las cadenas marcadas con H3-Td, lo estaban también con BrdU demostrando que, de hecho, estaban proliferando. Luego, se observó la desaparición de BrdU en las células que aún estaban marcadas con H3-Td, siendo esto consistente con la hipótesis de la hebra inmortal.

26. = H3-Td = BrdU Marcación con BrdU Progenie de Stem Cells

27. Resumiendo… • Según la Hipótesis de la Hebra Inmortal, en la replicación de las Stem Cells, se produciría una segregación asimétrica de las hebras parentales. • Esta segregación asimétrica estaría relacionada con la renovación de las Stem Cell. • Las hebras parentales (mayor antigüedad) segregan juntas para dar origen a una nueva SC, mientras que las hebras recién sintetizadas lo hacen en la célula más diferenciada.

28. Además… Este mecanismo permite la conservación de la información genética, evitando la acumulación de mutaciones en las SC y la formación de tumores.

29. Para completar… • Interrupción de la segregación asimétrica en las líneas de SC y análisis de la presencia de mutaciones e incidencia de tumores en el tejido. • A su vez, un SC que pierde la segregación no al azar, ¿puede generar otra SC o ambas hijas se diferencian? • Se debería extender el análisis a otros tejidos, los cuales generan otro tipo de diferenciación celular.

30. Immortal Strands? Give Me a Break Peter M. Lansdorp

31. Idea general La clasificación y división de cromosomas no se llevaría a cabo de acuerdo a la “edad” del material genético. Explicación alternativa: la división celular asimétrica y el destino de las células estaría codirigido por diferencias epigenéticas entre cromátidas hermanas.

32. Introducción Hipótesis de la hebra inmortal (1975) Mecanismo por el cual las células madre adultas minimizarían la acumulación de mutaciones que aparecen durante la replicación del DNA, las que podrían conducir al desarrollo de cáncer. Observado en un número muy limitado de tipos celulares; difícil de confirmar experimentalmente.

33. Parece probable que la segregación sea asimétrica en algunas células, pero quizás el “objetivo” no sea evitar la adquisición de mutaciones. • Otra posibilidad División asimétrica y destino celular codirigido por diferencias epigenéticas entre cromátidas hermanas.

34. Hebras inmortales: ¿existen? • Hipótesis sólo probada en sistemas mamíferos donde la identidad de las células madre es incierta. • Sistemas donde la división asimétrica ocurre ¿qué fracción de divisiones celulares comprende? • Evidencias que apoyan la hipótesis potenciales artefactos técnicos. • No hay mecanismos propuestos para la retención selectiva de la “hebra inmortal”.

35. Hipótesis difícil de reconciliar con: - Errores de replicación no son la única fuente de mutaciones modificaciones químicas. - Ambas hebras del DNA codifican genes ¿algunos genes mejor protegidos que otros? - Mecanismos de reparación del DNA involucran intercambios entre cromátidas hermanas interfiere con el mantenimiento de hebras inmortales. ¿“Suicidio altruísta”?

36. Células madre con segregación de hebra inmortal podrían dividirse más veces porque se evita el acortamiento de los telómeros sólo extremo 3´protegido (extremo 5´es procesado luego de la replicación). • Segregación selectiva previene acumulación de mutaciones, cáncer importancia de eventos epigenéticos en la formación de tumores.

37. ¿Son válidas los observaciones que avalan la hipótesis? • Número de estudios limitado. • Aproximaciones indirectas, limitaciones metodológicas obtención de células “individuales” evitaría artefactos como resultado de la fijación y el procesamiento. • Células que retienen la marca: ¿células madre ó postmitóticas diferenciadas? • Ilustraciones publicadas muestran imágenes cualitativas, no “cuantitativas”.

38. Sólo algunas células muestran segregación asimétrica • No hay evidencias de que las células de la línea germinal y células del embrión temprano muestren segregación asimétrica ¿por qué stem cells especializadas o progenitoras de células somáticas necesitarían más protección contra la acumulación de mutaciones? • Algunas células de rápida división y con segregación asimétrica no serían células madre células progenitoras que derivan de un pool de células madre con una tasa de renovación mucho más lenta.

39. ¿Existe otra explicación? Hipótesis alternativa • La hipótesis de la hebra inmortal presenta muchas objeciones. • Resultados experimentales apoyan fuertemente la hipótesis de la división asimétrica en ciertas células.

40. Hipótesis alternativa Lansdorp propone la hipótesis de la cromátida hermana silenciosa.

41. Acción de marcas epigenéticas Segregación de cromátidas no azarosa durante la mitosis. Expresión diferenciada de genes entre las células hijas. La naturaleza y construcción de las marcas epigenéticas es aún desconocida.

42. Hipótesis de la hebra inmortal Se presentan tres etapas de divisiones. Hay divisiones asimétricas en las células madre. El propósito es evitar la acumulación de errores en el DNA durante las sucesivas replicaciones. Hipótesis de la cromátida hermana silenciosa • Se presentan tres etapas de divisiones. • Hay divisiones asimétricas en las células madre. • El propósito es promover/silenciar la expresión de genes que regulan el destino celular.

43. High Incidence of Non-Random Template Strand Segregation and Asymmetric Fate Determination In Dividing Stem Cells and their ProgenyConboy M, Karasov A, Rando T

44. INTRODUCCIÓN

45. Segregación asimétrica de cromátidas hermanas

46. Antecedentes Originalmente observado en fibroblastos embrionarios y células del epitelio intestinal. Las poblaciones celulares in vivo en las que se observó este fenómeno son muy pequeñas. Estudios en células madre musculares (células satélite) con análogos halogenados de timidina dieron indicios de segregación asimétrica de cromátidas hermanas en la división celular.

47. Objetivos del proyecto • Estimar la incidencia de la segregación asimétrica en células miogénicas utilizando pulsos de análogos halogenados de timidina y analizando su progenie. • Contrastar los resultados obtenidos con las premisas que conforman la hipótesis de la hebra inmortal.

48. RESULTADOS

49. ¿Segregación asimétrica? Daño Músculo CldU (hebra madre) 2 días Primera ronda de mitosis IdU (hebra hija) 12 horas Segunda ronda de mitosis