Le piante transgeniche

1. Le piante transgeniche

2. Trasformazione genetica Un processo mediante il quale un fenotipo di un organismo può essere cambiato attraversi l’aggiunta di DNA esogeno L’organismo così generato è chiamato transgenico o Genetically Modified Organism (GMO)

3. Utilizzo e valore delle piante transgeniche Agricoltura • Miglioramento genetico • miglioramento delle peformance ‘Farmaceuticals’ / ‘Neutraceuticals’ • nuove colture per nuovi prodotti • piante ‘factories’ o ‘bio-reattori’ Ambiente • riduzione uso pesticidi • Bioremediation / phytoremediation

4. Modificazione delle piante: steps • Clonaggio (creazione della cassetta d’espressione del transgene) • Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo) • Selezione piante trasformate (uso di marcatori selettivi) • Screening del materiale con appropriata espressione genica • Isolamento delle linee omozigoti • test delle piante ottenute (analisi molecolari e d’espressione genica)

5. Modificazione delle piante: clonaggio Gene reporter/selettivo (es. Green Florescent Protein o Resistenza ad antibiotici) Gene d’interesse (es. tolleranza ad erbicidi o Resistenza a malattie) Elementi controllo espressione genica (es. solo in foglia o in seme)

6. Generazione di piante Transgeniche Agrobacterium tumefaciens Microiniezione Biolistico

7. Come vengono prodotte le piante transgeniche Molto diffusa la trasformazione via Agrobacterium • Funzione per la maggior parte delle dicotiledoni e per alcune moncotiledoni • non necessita di attrezzature specifiche e può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio

8. L’ Agrobacterium: un ingegnere naturale • L’ Agrobacterium tumefaciens è un batterio del suolo che causa la formazione di tumori (crown gall) nelle piante • Contiene il plasmide Ti (Tumor-inducing plasmid) • Il plasmide Ti possiede una regione di DNA, il T-DNA (Transferred-DNA), che viene incorporato nel DNA nucleare della painta infettata

9. Ti Plasmid T-DNA region • geni vir: essenziali per il trasferimento e l’integrazione della regione T-DNA • Auxine iaaM e iaaH : sintetizzano gli ormoni auxicini della crescita (acido indolacetico) Cytokinin Auxin Opine • Citochinine - gene tmr (ipt): genera la citochinina trans-zeatina. Promuovono la crescita cellulare e la formazione delle galle Left border Right border • Opine: sono prodotti di reazioni di condensazione tra aminoacidi e keto acidi (es. nopaline, octopine, agropine). Sintetizzate e secrete dalle galle sono utilizzate come fonte di carbonio dall’Agrobacterium 12-24 kbp Opine catabolism vir genes ori

10. Manipolazione genetica del plasmide Ti • La delezione dei geni auxinici e delle citochinine elimina la formazione delle galle • Sono stati inseriti dei marcatori selettivi batterici di E. coli (selectable shuttle vector) al di fuori della regione T-DNA • Inserimento di marcatori selettivi per pianta all’interno della regione T-DNA • Qualsiasi gene viene inserito all’interno della regione T-DNA sarà incorporato nel DNA della cellula vegetale (es. geni di resistenza ad erbicidi) • Le cellule vegetali trasformate vengono rigenerate come pianta intera attraverso la coltura in vitro. • Ogni cellula della nuova pianta conterrà il transgene

11. Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Agrobacterium Cellula vegetale T-DNA Nucleo Ti plasmid

12. Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Cellula vegetale ferita T-DNA Nucleo Ti plasmid Agrobacterium

13. Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Agrobacterium Segnale di ferita Cellula vegetale T-DNA nucleo Copia di T-DNA a singolo filamento (protetto da “ssDNA binding protein”)

14. Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale Agrobacterium Segnale di ferita Cellula vegetale T-DNA Nucleo T-DNA poro Chromatina Copia di T-DNA a singolo filamento (protetto da “ssDNA binding protein”)

15. Rigenerazione delle piante • L’agrobatterio viene inoculato sul tessuto vegetale • Il tessuto viene messo in coltura in piastre contenenti un antibiotico selettivo • I calli (tessuti indifferenziati) vengono trasferiti in un altro mezzo di coltura contenete ormoni di crescita che inducono la formazione di germogli e/o radici • Si può effettuare un controllo dei calli trasformati prima della loro rigenerazione attraverso un’analisi molecolare (es. PCR)

16. Bombardamento con Microproiettili (biolistico) • Proiettili sferici di oro o tungsteno (0.4 – 1.2m dia.) vengono ricoperti con il DNA • Questi proiettili vengono sparati ad alta velocità (3-600 metri/sec) mediante un’apparecchiatura (particle gun) utilizzando aria compressa o gas compresso (elio) • Il proietticle penetra la parete cellulare e le membrane (trasformazione d cloroplasti o mitocondri) • Possono essere trasformate un gran numero di specie (anche monocotiledoni) che non sono suscettibili al trasferimento di DNA via Agrobacterium. • Questo metodo può essere utilizzato anche per sospensioni cellulari, colture di calli, tessuti meristematici, embrioni immaturi, coleoptili e polline.

17. Il transgene: RNA Antisenso • Questa tecnica viene utilizzata normalmente nelle piante per bloccare l’espressione di geni endogeni. • Frammenti clonati di geni vengono posti nel trasgene in orientamento inverso vicino ad un promotore. • Quando questo transgene antisenso viene reintrodotto nelle cellule vegetali previene in qualche modo la produzione della proteina endogena. • Non si ha un copleto knock-out del gene . Si può avere una debole o una maggiore produzione della proteina.

18. Alterazione della maturazione dei frutti mediante RNA Antisenso • La Poligalatturonase (PG) è un enzima che abbassa la pectina nelle pareti dei frutti in maturazione • Le piante transgeniche con PG antisenso (FLAVR SAVR tomato) producono poco PG. Le pareti si ammorbidiscono molto lentamente Frutto Wild-type Attività PG Frutto PG Antisenso • Molti geni sono stati manipolati in modo analogo per rispordere ad alcune questioni basilari: - qual’è il ruolo degli ormoni nella maturazione dei frutti? - quali enzimi agiscono nella parete dei frutti ? 0 2 4 6 8 10 Giorni dal primo cambiamento del colore

19. Il transgene: RNAi Una tecnica,che merita particolare attenzione, e che è stata introdotta solo di recente, è quella che permette di interferire con l’espressione di alcuni geni dannosi mediante la trasfezione di piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in grado di antagonizzare l’RNA messaggero corrispondente (“ RNA INTERFERENCE”).La tecnologia dell’RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico, presente in piante e animali, innescato da RNA a doppia elica (dsRNA) omologo alla sequenza del gene da sopprimere. Diffusamente utilizzato in Caenorhabditis (nematode) – lavora anche in Drosophila, nei trypanosomi e in pianta

20.  In questo fiore un gene che controlla la produzione di pigmento viola è stato disattivato mentre il fiore era in crescita. Le cellule che si sono sviluppate dopo questo intervento risultano bianche in quanto I pigmenti viola non venivano più prodotti. Courtesy of Dr. Richard Jorgensen, University of Arizona. RNAi

21. Il gene FLC quando viene silenziato produce precocemente I fiori in quanto la sua funzione è proprio quella di reprimere la fioritura. (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). Chalcone synthase gioca un ruolo nella formazione dei pigmenti in pianta. Il suo silenziamento produce semi giallo pallido (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). EIN-2 è un gene responsabile della percezione dell’etilene gene (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). GUS è ilgene reporter molto utilizzato(Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590). • Phytoene desaturase è un gene che quandi viene silenziato forma piante bianche. Questo perchè I carotenoidi prevengono il fotosbiancamento della clorofilla.(Helliwell et al., 2002, Functional Plant Biology, 29: 1217-1225). RNAi

22. Il transgene: Gene ‘stacking’ o ‘pyramiding’ Utilizzato già nel breeding tradizionale delle piante (“Gene stacking” è la combinazione attraverso l’incrocio e la selezione della pregenie di tratti desiderati in un’unica linea) Biotecnologie : nuove strategie di co-espressione • Quando è necessario co-esprimere geni multipli • pathway biochemiche • enzimi multimerici • proteine multiple che controllano diversi ‘choke points’ nelle biosintesi .

23. Miglioramento della tolleranza in pianta di stress abiotici clima Suolo Temperatura (caldo, freddo) Disponibilità di nutrienti Idrico (siccità, asfissia) Acidità e alcalinità Stimoli meccanici (vento) luce troppa poca Inquinanti Metalli pesanti Ozono Applicazioneprodottichimici erbicidi

24. Erbicidi e problema delle infestanti 10% della perdita di produzione nelle colture è causata dale malerbe > $10 billioni vengono spesi annualmente in erbicidi • Moltio erbicidi sono attivi contro le colture • - spesso devono essere distribuiti precocemente per precauzione Molti erbicidi sono persistenti nel suolo o lasciano residui tossici Il tillage (ploughing) può essere utilizzato per il controlllo delle malerbe ma può prvocare serie perdite d’acqua

25. Modalità d’ingegnerizzazione per tolleranza ad erbicidi • Esistono più di 100 diversi erbicidi con varie modalità d’azione • Molti erbicidi agiscono interferendo con enzimi chiave • Molti agiscono a livello di cloroplasti • Le piante variano nel loro livello di sensibiltà agli erbicidi. Alcune sono capaci di: (a) Produrre enzimi che inattivano erbicidi particolari (b) Produrre un target alterato di enzimi, insensibili a particolari erbicidi (c) Inibire l’uptake dell’erbicida • Le colture possono essere ingegnerizzate per tolleranza aparticolari erbicidi attraverso l’inserimento di singoli nuovi geni

26. La tolleranza ad erbicidi è il tratto dominante delle colture GM coltivate a livello commerciale 74% di colture GM coltivate nel 2000 erano tollaranti ad erbicidi (HT) 7% ‘stacked transgenes’ (HT + Bt gene per resistenza ad insetti) % delle colture GM globali coltura tratto soia* HT 58% colza HT 6% mais HT 5% cotone HT 5% cotone HT+Bt 4% mais HT+Bt 3% (* 36% della soia coltivata nel mondo è transgenica)

27. Colture tolleranti al Glyphosate Le prime colture ingegnerizzate messe in commercio sono state quelle con tolleranza all’erbicida glyphosate (Roundup) Attualmente molte colture presentano inserito questo tratto transgenico (soiia, mais, colza, cotone ecc) Colza tollerante

28. Ingegnerizzazione per tolleranza a Glyphosate Il Glyphosate inibisce un enzima cloroplastico essenziale nella biosintesi degli aminoacidi : 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic acid synthase (EPSPS) Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione tradizionale Un mutante del gene EPSPS è stato isolato da Agrobacterium, che introdotto in pianta conferisce tolleranza al glyphosate

29. tp polyA+ EPSPS Transgene introdotto in pianta Transit peptide from plant gene added to allow chloroplast import Codon usage modified for efficient expression in plants promoter Agro. EPSPS Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). In this case 35S CaMV promoter

30. H HOOC CH2 CH2 C COOH NH2 O H CH3 P CH2 CH2 C COOH OH NH2 Ingegnerizzazione tolleranza a Phosphinothricina L-phosphinotricina è un ingrediente attivo negli erbicidi glufosinate / bialaphos Questi erbicidi agiscono inibendo la glutamine synthetase (GS) - GS necessaria per la sintesi di glutamine da glutamate e ammonio - GS previene l’accumulo di ammonio a livelli tossici nelle cellule vegetali glutamate L-phosphinotricina

31. Piante tolleranti a Phosphinothricina Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione tradizionale - trasformare piante con un mutante GS insensibile alla phosphinotricina - trasformare il gene delle piante per un enzima che inattiva la phosphinotricina I geni batterici (pat o bar ) che codificano per phosphinothricin acetyl transferase sono stati trasferiti in pianta detossificano L-phosphinotricina attraverso acetilazione, così GS non è inibita Coltivazioni commerciali di Cicoria, rape e mais tolleranti a Phosphinothricina

32. Tolleranza a Phosphinotricina Introdotta in pianta Codon usage modified for efficient expression in plants polyA promoter Bacterial pat Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). Frequently use 35S CaMV promoter

33. Tolleranza a stress ambientali Il progresso per gli stress ambientali attraverso il breeding classico è andato molto lentamente Crop Maize Wheat Soyabean Sorghum Oat Abiotic losses (% record yield) 66% 82% 69% 81% 75% La tolleranza di solito coinvolge molti geni e processi fisiologici L’approccio transgenico ha dovuto sffrontare anche questi problemi ma alcuni progressi sonos stati fatti anche se ancora non ci sono piante in commercio

34. Risposta della pianta allo stress Ozono Riconoscimento stress Temperature estreme Stress transduction asfissia Alterazione Espressione genica siccità Alterazione metabolismo salinità Risposte fisiologiche/ sviluppo

35. Fattori di transcrizione Risposta della pianta allo stress Riconoscimento stress ? ? Ca2+ Hormones Stress transduction Alterazione Espressione genica Caratteri multigenici Alterazione metabolismo Es. • Antiossidanti prodotti in risposta a molti stress per detossificare dai radicali liberi (reactive oxygen species -ROS) • Soluti compatibili (osmo-protectants) sostanze osmoprotettive prodotte da alcune piante in risposta a stress osmotici come siccità e salinità • heat-shock proteins (HSPs) accumulate in seguito a stress da calore

36. Resistenza a siccità/salinità Trehalosio è un osmoprotettivo contro stress ambientali: congelamento, salinità, caldo e essiccazione. Il Trehalose (1--D-glucopyranosyl-glucopyranoside) è sintetizzato in due steps nei lieviti. Zygosaccharomyces rouxii è uno dei lieviti più osmo-tolleranti, specialmente al sale. Kwon, S.J., Hwang, E.W. & Kwon, H.B. (2004). Genetic engineering of drought resistant potato plants by co-introduction of genes encoding trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase of Zygosaccharomyces rouxii. Korean J. Genet.26, 199-206. Patate transgeniche mofologicamente uguali ai parentali NS ter NS prom trehalose-6-P synthase trehalose-6-P phosphotase nptII CaMV 35S LB 2A RB

37. Piante transgeniche per resistenza a malattie

38. Impatto delle malattie sulle colture La colture sono spesso coltivate in modo estensivo e in monocoltura. Incremento del rischio di malattie epidemiche Le malattie limitano in modo significativo la produttività e richiedono sostanziali apporti di prodotti chimici. Crop Maize Wheat Soyabean Sorghum Oat Biotic losses* (% average yield) 42% 39% 41% 37% 54% * Biotic losses include diseases, insects and weeds

39. Breeding tradizionale • insetti e funghi sono molto più distruttivi di virus e batteri • In alcuni casi, con il breeding tradizionale si è potuto introdurre geni di resistenza da specie selvatiche a specie coltivate. • Per alcune malattie non sono stati trovati geni di resistenza efficaci e durevoli • Riduzione della suscettibilità ai geni di resistenza continua necessità di ricerca fonti di gene di resistenza

40. Vantaggi delle Transgeniche Nessuna restrizione legata ad incompatibilità sessuale Introduzione di resistenze in specie che in natura non presentano fonti di resistenze Colture GM per resistenza ad insetti e virus sono commercializzate in USA Transgenic insect and viral resistant crops are already grown commercially in US e altri Paesi: - mais, cotone, patata, pomodoro resistente ad insetti - patata, papaya, zucchini resistenti a virus

41. Resistenza ad insetti La resistenza ad insetti è il secondo più importatnte tratto tansgenico nelle colture commerciali GM 19% delle colture GM per resistenza ad insetti contengono il gene Bt Un’altro 7% sono Bt + tolleranza ad erbicidi % of global Crop Trait GM crops Bt 15% Maize Bt + HT 4% Cotton Bt 3% Cotton Bt + HT 3% Maize

42. Tossine Bt Le tossine prodotte da Bacillus thuringiensis uccidono solo gli insetti Diversi ceppi di Bacillus thuringiensis producono diverse tossine, ciascuna attuiva solo per uo o poche specie d’insetti. Le spore batteriche o isolati della tossina sono già disponibili come insetticidi organici

43. Tossine Bt Tossine prodotte nelle spore, e formano cristalli proteici Le tossine codificate da geni Cry • Attività della tossina; • protossina è digerita nell’intestino da proteasi + pH alcalino • protossina si lega ad un sito specifico sulla parete intestinale • avvengono ulcerazioni e diminuisce l’appetito • si ha la rottura della parete intestinale, larve muoiono

44. Colture Bt Alcune colture (cotone, mais, patata ecc.) sono state trasformate con diverso geni Cry che producono tossine attive contro alcuni erbivori. Ad oggi sono stati utilizzati più di 40 diversi geni Cry Codon usage modificato per un’efficiente espressione in pianta polyA Bt Cry promotore Sequenze regolatrici riconosciute dalla pianta

45. Colture Bt • Regole di conduzione per minimizzare l’insorgenze di resistenza a Bt • 20% mais non-BT (50% cotone non-Bt) in campo; • Monitoraggio Introduzione di resistenze multiple incremento dei livelli d’espressione impatto con insetti non-target: ‘buffer zone’ di mais non Bt intorno a mais BT ‘Transgenic pollen harms monarch larvae". J.E. Losey et al., Nature 20 May 1999 (correspondence).È stato molto criticato per dati riferiti ad un solo anno, per uso di larve molto suscettibili.I lavori attuali riportano pochi se non effetti nulli, giusta comparazione con campi trattati con insetticidi

46. Resistenza a Virus “RNA-mediated interference”:si basa sull’espressione di geni patogeno-derivati o da frammenti di geni (es. Resistenza patogeno derivata) Interferisce con I normali processi patogenici del microbo sia a livello proteico (resistenza virale e batterica) sia a livello di RNA ( solo resistenza virale). “Protein-mediated interference”: - espressione di una tossina derivata batterica, inattivando l’enzima per controllare specifici Pseudomonas - espressione costitutiva di “coat protein” virali (CPs) o proteine di movimento (MPs) per la protezione di piante a virosi. Non si conosce bene il meccanismo d’interferenza mediata dalle proteine. - necessari livelli di espressione elevati di “coat protein”

47. Papaya ringspot virus (PRV) Questo virus ha avuto un enorme impatto in Hawaii , con forti riduzioni nella produzione di frutti freschi Non esistono in natura geni di resistenza a questo virus, e senza la produzione di papaya transgenica la produzione industriale nelle Hawaii potrebbe essere distrutta. Dal 1996 nelle hawaii si coltiva papaya PRV resistente.

48. Resistenza a PRV in Papaya Il gene della coat protein di viene espresso mediante il promotore 35S CaMV. La papaya è stata trasformata attraverso metodo biolistico. promoter polyA+ PRV coat protein gene Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). In this case 35S CaMV promoter and terminator Questo gene conferisce resistenza parziale a PRV in una varietà (‘Rainbow’) e resistenza completa in un’altra (‘SunUp’) Gli agricoltori gestiscono la coltivazione con molta cura per minimizzare la pressione di selezione sui virus per il mantenimento della resistenza.

49. Would it surprise you to know that saving a crop from a virus helped save a community from disaster? Through advancements in plant biotechnology, researchers developed a type of papaya that is resistant to a virus that was destroying Hawaii’s crops. This healthier plant not only kept Hawaiian farming communities in business, it also resulted in an increase in papaya production. And its just one example of how crops enhanced by plant bio- technology could one day help feed an ever-increasing world population. The research is on- going and the facts are there to be examined. If you want to learn more we invite you to call us or visit our web site: www.whybiotech.com Council for Biotechnology Information

50. Resistenza multipla a virus in zucchini Geni “Coat protein” per 3 virosi (cucumber mosaic virus CMV; zucchini yellow mosaic virus ZYMV; watermelon mosaic virus 2 WMV 2) sono stati introdotti in Cucurbita pepo - tutti espressi dal promotore 35S CaMV CMV CP ZYMV CP WMV 2 CP LB RB t t t nptII Prom Prom Prom Prom = promoter t = terminator protegge contro I 3 virus