Ústav lekárskej biológie, LF UPJŠ v Košiciach

1. Ústav lekárskej biológie, LF UPJŠ v Košiciach CYTOGENETIKA CHROMOZÓMY KARYOTYP

2. Takmer celý obsah DNA eukaryotickej bunky sa nachádza v jadre, kde spolu s bielkovinami vytvára štruktúry – chromozómy – viditeľne v deliacej fáze – mitóze. V nedeliacom sa jadre sa chromozómy javia ako granulárna masa – CHROMATÍN (chromozómy sú hydratované, dekondenzované a rozvinuté)

3. Heterochromatín a euchromatín • Euchromatín • predstavuje časti chromozómov obsahujúce množstvo génov • Je kondenzovaný do voľných slučiek 30-nm vláken. • Je oddelený od priľahlých oblastí heterochromatínu inzulátormi. • Slučky heterochromatínu sú zväčša lokalizované v blízkosti komplexov jadrových pórov. Heterochromatín • predstavuje časti chromozómov obsahujúce málo alebo žiadne gény,ako napr. • centroméry a teloméry • je kondenzovaný • môže obsahovať transpozóny a "junk" DNA; • je replikovaný v neskorej S-fáze b. cyklu; • crossing over v meióze je zriedkavý • génylokalizovanévheterochromatínesú vo všeobecnosti inaktívne, t.j. nie sú transkribované

5. a) c) b) d)

8. DNA Nukleozómové vlákno (11 nm) Chromatínové vlákno (30 nm) Chromatínové slučky (300 nm) Heterochromatín (700 nm) Chromozóm

9. Eukaryotické chromozómy - genetické jednotky bunky zložené z DNA a bielkovín Chemické zloženie chromozómov • DNA: jedna lineárna dvojvláknová molekula (napr. ľudský chromozóm č.1 – 2,5x108bp – cca. 15cm, najmenší chromozóm č.21 – 0,5x108bp – cca. 3 cm) • RNA: molekuly rRNA, tRNA a mRNA transkribované z DNA • Bielkoviny: významná zložka chromozómov euk. buniek. Podľa charakteru delíme na: • históny – bázické bielkoviny (Lys, Arg, His) • nehistónové bielkoviny Pomer NK a bielkovín je 60% ku 40%

10. Históny Malé molekuly bázických bielkovín (100-200 AMK). Bola zistená evolučná stálosť sekvencií AMK v reťazci histónov, takmer 100% zhoda (rast., živoč., človek). Históny sú syntetizované v plazme. Typy histónov: H1, H2A, H2B, H3, H4 Jednotlivé históny sa líšia svojou štruktúrou a chem. zložením. V spermiách cicavcov sú históny viac bázické. Funkcia histónov: - priestorové usporiadanie DNA do nadmolekulovej štruktúry pri tvorbe chromozómu. Regulácia transkripcie. Nehistónové bielkoviny: kyslý charakter, viac ako 100 druhov bielkovín – enzýmy – replikácia – transkripcia – génové regulácie

11. Históny majú pozitívny elektrický náboj, preto môžu vytvárať iónové väzby s negatívne nabitými fosfátovými skupinami v DNA • Chromatínové vlákno je usporiadané do veľkého počtu slučiek, ktoré vyčnievajú z centrálneho skeletu tvoreného nehistónovými chrom. proteínmi • Pri kondenzácii dochádza ku kontrakcii NHC (non-histone chrom. proteins)

12. Submikroskopická štruktúra chromozómu • zložitá nadmolekulárna organizácia DNA a histónových bielkovín • celková dĺžka DNA v ľudskej diploidnej bunke (1,5 – 2 m) – 3x109 bp, veľkosť jadra (5-10 mikrónov) • základná submikroskopická jednotka chromozómu je nukleozóm

14. Nukleozóm: sa skladá z jadra a DNA (200bp) Nukleozómové jadro: oktamér 2xH2A, H2B, H3 a H4 (kladne nabitý). DNA vytvára 2 otáčky okolo nukleozómu. H1 slúži ako viazač DNA medzi dvoma nukleozómami. Nukleozómové vlákno

15. Mikroskopická štruktúra chromozómu teloméra p-ramienko q-ramienko teloméra Chromozómy svetelným mikroskopom môžeme pozorovať a hodnotiť v metafáze bunkového delenia. Morfológia chromozómov sa hodnotí podľa umiestnenia centroméry, kt. spája dve dcérske chromatidy a rozdeľuje chromozóm na p a q rameno. Medzi morfologické charakteristiky patrí aj veľkosť chromozómu a morfologická štruktúra.

16. Počet chromozómov Pre každý biologický druh je charakteristický počet chromozómov (diploidný počet (2n) – telové bunky, haploidný počet (n) - gaméty) Príklady počtu chromozómov u rôznych druhov: Druh Diploidný počet (2n) Plazmódium malárie 2 Drozofila melanogaster 8 Rak 116 Kapor 104 Pes 78 Hov. Dobytok 60 Kôň 66 Myš 40 Šimpanz, orangutan, gorila 48 Človek 46

17. Teloméry - Telomeráza Teloméry: koncové časti chromozómov so špeciálnou sekvenciou dusíkatých báz, kt. ohraničujú koncové časti pred zlomami, kt. uľahčujú fúziu chromozómov a prestavby chromozómov – chromozómové mutácie Telomeráza: enzým, nukleoproteín – okrem proteínovej zložky má zabudovanú v molekule aj sekvenciu ribonukleotidov – CCCAAU (človek). Význam telomerázy je v kompletizácii zaostávajúceho vlákna DNA v dôsledku zostrihu primerov RNA, kt. zahajujú replikáciu DNA v Okazakiho fragmentoch.

19. Každý biologický druh má svoj charakteristický karyotyp – genetická charakteristika. metacentrický submetacentrický akrocentrický telocentrický

20. Chromozómy v diploidnej bunke sa vyskytujú v pároch. Pár chromozómov zhodných v tvare a štruktúre sa označuje ako homologický pár.

21. Podľa určenia pohlavia chromozómy delíme: • telové, somatické, autozómy • pohlavné, gonozómy, sex-chromozómy, heterochromozómy • Podľa intenzity farbenia chromozómu rozoznávame: • heterochromatínové časti (centroméry, teloméry), geneticky neaktívne časti, kt. sa replikujú v neskorej S-fáze – výraznejšie farbiteľné časti • euchromatínové časti – menej výrazne farbiteľné časti, genetický aktívne, dokonale dekondenzované a odvinuté

24. Ku správnemu určeniu počtu chromozómov prispela modifikácia metódy, aplikácia fytohemaglutinínu (PHA) – stimulácia delenia leu, hlavne aplikácia kolchicínu – zastavenie mitózy v metafáze a použitie hypotonického roztoku, kt. spôsobil disperziu chromozómov v priestore. Klasifikácia chromozómov u človeka – Denverská (1961), Parížska (1972) počet Skupina Charakteristika Autozómy Gonozómy Muž Žena A najväčšie metacentrické 1-3 - 6 6 B veľké submetacentrické 4-5 - 4 4 C stredne veľké submetacentrické 6-12 X 15 16 D väčšie akrocentrické 13-15 - 6 6 E malé metacentrické 16-18 - 6 6 F najmenšie metacentrické 19-20 - 4 4 G najmenšie akrocentrické 21-22 Y 5 4 46 46

25. Súbor chromozómov diploidnej bunky s charakteristickým tvarom a počtom chromozómov sa volá KARYOTYP.

26. Presný počet chromozómov v diploidnej bunke u človeka stanovili Tjio a Levan v roku 1956, keď dokázali, že človek má 46 chromozómov. Do uvedeného obdobia sa za pravdivý považoval fakt, že ľudské bunky majú 48 chromozómov.

27. Štruktúra ľudských chromozómov DNA eukar. bunky je rozdelená do jednotlivých chromozómov, kt. predstavujú samostatné molekuly DNA.

36. Poznanie štruktúry chromozómov prispelo k rozvoju nového odvetvia genetiky – CYTOGENETIKY, čo našlo uplatnenie aj klinickej genetike. Potvrdzuje to aj fakt, že už v 60. rokoch bol cytogenetický diagnostikovaný Downov sy.,Edwardsov sy., Patauov sy. a iné • Uplatnenie cytogenetickej analýzy: • diagnostická metóda – určenie syndrómov • diagnostika VVCH • diagnostika nádorov (leukémia) • prenatálna diagnostika (bunky plodu) • -hodnotenie buniek za spontánnych potratov a iných reprod. problémov • -hodnotenie chromozómov u rizikových profesií (mutagény) • -in vitro experimenty na mutagenézu nových chemikálií, liekov, prísad do potravín

40. Diabetes mellitus and deafness (DAD) • this combination at an early age can be due to mitochondrial disease • Diabetes mellitus and deafness can be found together for other reasons as well • Leber hereditary optic neuropathy (LHON) • visual loss beginning in young adulthood • Wolff-Parkinson-White syndrome • multiple sclerosis-type disease • Leigh syndrome, subacute sclerosing encephalopathy • after normal development the disease usually begins late in the first year of life, but the onset may occur in adulthood • a rapid decline in function occurs and is marked by seizures, altered states of consciousness, dementia, ventilatory failure • Neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis (NARP) • progressive symptoms as described in the acronym • dementia • Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy (MNGIE) • gastrointestinal pseudo-obstruction • neuropathy

42. DELENIE BUNIEK

43. Delenie buniek • základná charakteristika života • vznik nových buniek delením existujúcich • Význam delenia buniek: • U jednobunkových organizmov delenie – rozmnožovanie • U mnohobunkových organizmov – delenie zygoty a následné bunkové delenia – embryonálny vývoj, delenia v postembyonálnom vývoji – rast organizmu • Náhrada strát buniek v dôsledku fyziologického opotrebovania (erytrocyty, bunky epidermis 1010/deň), patologických procesov a mechanického poškodenia buniek

44. Typy bunkového delenia • priame delenie – amitóza • nepriame delenie – mitóza • redukčné delenie - meióza Priame delenie: - prokaryotické bunky Replikácia kruhovej DNA je nasledovaná priečnym rozdelením bunky (30-60 min.). Materská bunka Dcérske bunky

45. cytokinesis Mitotické delenie: -nepriame delenie – prebieha v jednotlivých fázach, kt. reprezentujú bunkový cyklus (cyklické striedanie dejov v období od vzniku dcéskej bunky po jej opätovné rozdelenie). • Medzi hlavné fázy bunkového cyklu patria: • interfáza – 3 štádia : G1 – S – G2 • mitotická fáza – 5 štádií : profáza, metafáza, anafáza, telofáza, cytokinéza

46. G1 štádium: -postmitotické štádium – od vzniku dcérskej bunky po S – štádium -35% trvania bunkového cyklu (výrazná variabilita – 10-180 hodín) Prejavuje sa tu adaptačná schopnosť na vonkajšie podmienky, zrýchľovanie a spomaľovanie bunk. cyklu. Ak bunka nepokračuje v bunk. cykle zostáva v G1 štádiu resp. v G0, bunka vykonáva metabolické procesy (proteosyntéza), ale na bunkové delenie sa aktívne nepripravuje. G0 štádium je charakteristické pre kmeňové, pluripotentné bunky napr.: bunky krvotvorby, epidermis. - hlavný kontrolný uzol – regulácia bunk. cyklu – rozhoduje o pokračovaní bunky do S-štádia ak sú splnené podmienky: kritický objem, syntéza enzýmov a iných biopolymérov, syntéza RNA a DNA polymeráz

47. S štádium: -syntetické štádium DNA, naväzuje na G1 v prípade, že boli uskutočnené nutné deje a bunka má priaznivé podmienky pre syntézu DNA. -trvanie S-štádia konštantné pre daný typ buniek (8-20 hod. = cca.45% bunk. cyklu) -výsledok: vznik tetraploidnej bunky  vznik dvoch chromatíd (reduplikácia chromozómov) Okrem replikácie DNA v štádiu prebieha syntéza histónových bielkovín, riadená asi 40 génmi (syntéza mtDNA je nezávislá na syntéze jadrovej DNA).

48. G2 štádium: -postsyntetické, relatívne krátke trvanie (10% bunk. cyklu) -pokračuje syntéza bielkovín -rast bunkových organel -syntéza mitotického aparátu (tubulín, kinetochórové vlákna) -V tomto štádiu sa nachádza kontrolný uzol rozhodnutie o vstupe bunky do mitózy

49. MITOTICKÁ FÁZA (mitóza) -trvá asi 10% bunkového cyklu (1-1,5 hod.), dĺžka trvania je konštantná PROFÁZA -rozsiahle prestavby v cytoplazme a jadre bunky. V cytoplazme sa centriol rozdelí na dve časti, kt. putujú k pólom bunky. Tvorí sa mitotický aparát a ku koncu profázy sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú ku kinetochóru. V jadre sa stráca jadierko, chromozómy sa dehydratujú a špiralizujú – stávajú sa viditeľnými. Neskôr na konci profázy sa stráca jadrová membrána, kt. sa stáva súčasťou ER. Trvanie: 30 min.

50. METAFÁZA -chromozómy sa ešte viacej kondenzujú a stávajú sa viditeľnejšími V dôsledku pripojenie mikrotubúl deliaceho vretienka sú chromozómy stabilizované v tzv. rovníkovej rovine. Chromatidy sú stále spojené v mieste centroméry. Trvanie: 3 min. ANAFÁZA -pozdĺžne rozdelenie chromozómu na chromatídy, kt. reprezentujú chromozómy budúcich dcérskych buniek. Rýchlosť pohybu chromozómov 1 mikrón/s. Trvanie: 5 min.