Concentración de Clorofila-a

1. Concentración de Clorofila-a Métodos de Medición

2. La clorofila fue descubierta en1817 por los químicos franceses Pelletier y Caventou, que consiguieron aislarla de las hojas de las plantas. Pelletier introdujo los métodos, basados en la utilización de solventes suaves, que permitieron por primera vez aislar no sólo la clorofila, sino sustancias de gran importancia farmacológica como la cafeína o la quinina. • Es considerada el indicador universal de biomasa fitoplanctonica. • METODOS DE MEDICION • Espectrofotometria Parsons & Strickland,1963 UNESCO, 1966 Lorenzen, 1967 Jeffrey & Humphrey, 1975 • Fluorometria Holm-Hansen et al., 1965 1970’s – 1980’s Mantoura & Llewellyn, 1983 Wright & Shearer, 1984 • HPLC (Cromatografía) Revision: Jeffrey, Mantoura & Wright, 1997. Pigments in oceanography. UNESCO.

3. Muestra Solvente CENTRIFUGA Base de los Métodos: • Filtrado de un volumen conocido • Reserva del Filtro en sobre de papel aluminio y en N2 Liquido (Congelador por no mas de 30 dias). • Pre-preparado del filtro (opcional) • Extracción de la clorofila-a usando un solvente (Acetona 90%, 100%, Metanol, …) también en un volumen conocido. • Centrifugación del extracto • Lectura del Extracto (Espectrofotómetro/Fluorometro)

4. PREPARACION DEL FILTRO • Colocar directamente en extracción • Destruir el filtro usando un bastón de vidrio (Grinding) • Sonicador

5. Clorofila-a • Pigmentos de color verde • Espectro de absorcion con dos picos centrados a 440 nm y 675 nm (depende in vivo, solvente). • Estructura molecular con anillo de profirina con liga doble, ion Mg y cadena de Fitol. • Existen tres tipos principales: a, b y c (divinil-chl-a, -b, chl-c1, -c2, -c3). • Presentan Fluorescencia (máx. a 680 nm) • Fotoquímica y captura de luz.

6. Absorción y Fluorescencia semejantes a la Clorofila-a Consecuencias en las lecturas en Espectro y Fluorimetro

7. TIPOS DE FILTROS

9. SOLVENTES • Acetona 90% - se le agrega el 10% de agua para disminuir la “flamabilidad” - Eficiente y el mas utilizado - En HPLC no se recomienda al 90% por formación de clorofilase. • Metanol - mas eficiente que acetona para muchas algas verdes y cianobacterias, pero esto puede variar con la especie. • Dimetil Sulfoxido (DMSO) – toxico (algas mas resistentes) • Dimetil Formamida (DMF) – toxico (algas mas resistentes) • Dimetil Acetamide – hay pocas pruebas • Etanol – Muy utilizado en fito de agua duclce.

10. Jeffrey et al., 1997

12. Espectrofotómetros 1 – 5 cm

13. Acetona 90%: 664 nm

15. Modificación para corregir feopigmentos (Lorenzen, 1967):

16. Acetona 90%: 664 nm 665 nm 647 nm 630 nm

17. Ecuación Final

18. Fluorescenciay Fluorometros Principio: - Excitación de la clorofila por luz Azul (~ 436 nm) - Emisión de Fluorescencia en Rojo (685 nm)

19. Ventajas del Método • 2 a 3 ordenes de magnitud mas sensible que espectrofotometria • Chla < 0.1 mg.L-1 • Mas de 30 anos de uso (Holm-Hansen et al, 1965).

20. Desventajas: Problema de los Feopigmentos Presencia de Clb Aun así, su uso se expande pque se creía que en aguas oceánicas no había especies con cl-b

21. Lámparas de Excitación/Emisión mas usadas + usuales Propuesta de Welshmeyer, 1994 (Turner 10-AU) Recomendación: No usar el método de acidificacion cuando se sabe que las aguas contienen significativa concentracion de clb (aguas dulces o marinas dominadas por clorofitas o prasinofitas) – Jeffrey et al, 1997

23. Welshmeyer, 1994