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Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a PulseNet: Shigella flexneri y

Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a PulseNet: Shigella flexneri y Enterobacter sakazakii. 5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL). 23 al 25 de octubre 2007. Norma Binsztein Angela Salve. Desarrollo de protocolo estandarizado de PFGE para incorporación de

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Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a PulseNet: Shigella flexneri y

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Presentation Transcript

  1. Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a PulseNet: Shigella flexneri y Enterobacter sakazakii 5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL) 23 al 25 de octubre 2007 Norma Binsztein Angela Salve

  2. Desarrollo de protocolo estandarizado de PFGE para incorporación de Shigella flexneri a PulseNet

  3. Necesidades de un protocolo diferente a)Shigella flexneri especie mas frecuente en América Latina y en Asia b) PFGE de Shigella sonnei estandarizado en PulseNet c) Resultados de PFGE de aislamientos de Shigella flexneri con el protocolo de Shigella sonnei d) Pedido de PN-AL a PN-Internacional de estandarizar protocolo de PFGE para Shigella flexneri aceptación

  4. Objetivo Estandarizar un protocolo de PFGE y análisis para Shigella flexneri Objetivos específicos • Utilizar las mismas condiciones de corrida para dos enzimas • Simple, económico, reproducible y epidemiológicamente • discriminatorio

  5. Antecedentes

  6. Grupo de trabajo en PFGE y BioNumerics de Shigella flexneri • Reunión Comité Directivo de PN Internacional • Providence, USA - 16 de Abril 2007 • Presentación de resultados preliminares • (CDC e Instituto Malbrán) • Integrantes • CDC • NAMRU (US Naval Medical Rescarch Unit • INEI – Malbrán

  7. Protocolo de trabajo 1ª etapa: Mayo a Octubre 2007 Campylobacter vs Yersinia modificado • Condiciones de corrida • EnzimasXbaI y NotI • Aislamientos seleccionados • - 7 de cada serotipo de Shigella flexneri • - de brotes 2ª etapa: Validación

  8. Conclusiones preliminares1º etapa • Condición de corrida • protocolo Yersinia modificado • Enzimas XbaI y NotI • 1ª enzima NotI • 2ª enzima XbaI • Buena discriminación de aislamientos asociados • a brotes Ventajas y Desventajas ? Definición: noviembre 2007

  9. 3 1 2 3 4 5 6 7 2 1 4 5 6 7 Ejemplos: XbaI-PFGE Shigella flexneri 1, digeridas con XbaI con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado Protocolo Campylobacter 6,8 a 35,4 seg Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg

  10. 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Ejemplos: NotI-PFGE Shigella flexneri 1, digeridas con NotI, con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado Protocolo Campylobacter 6,8 a 35,4 seg Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg

  11. Desarrollo de protocolo estandarizado de PFGE para incorporación de Enterobacter sakazakii a PulseNet

  12. Enterobacter sakazakii PulseNet América Latina está a cargo del desarrollo Antecedente 2006: PFGE de 22 aislamientos con la condición de corrida de Shigella sonnei enzima XbaI Resultados a mejorar Condición de corrida: Yersinia modificado enzima XbaI

  13. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Enterobacter sakazakii 2007Resultados preliminares XbaI-PFGE Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg Protocolo Shigella sonnei 2,2 a 54,2 seg

  14. Enterobacter sakazakiiPlan de trabajo 2007-2008 • Continuar el estudio de todos los aislamientos • existentes en la colección de cultivos del INEI (n=22) • - condiciones Yersinia modificado • - enzimas XbaI y otra a elegir • Realizar el análisis y comparación de los resultados con los dos protocolos (Shigella sonnei y Yersinia modificado) • Discutir los resultados en el Comité Ejecutivo de PN-Internacional • Seleccionar método • Validar

  15. Modificaciones del protocolo estandarizado de PFGE para Salmonella sp., Shigella sonnei y E. coli O157 5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL) 23 al 25 de octubre 2007 Angela Salve

  16. Principales Modificaciones • DO de las suspensiones bacterianas • DO de 1.0 a 610 nm • NO AGREGAR SDS al 1% en la agarosa utilizada en la preparación de los “plugs”. • Se puede usar una menor cantidad de enzima por “plug” (20 - 30 U)

  17. Utilización de Tiourea en cepas No Tipificables

  18. Cepas No Tipificables • Hay aislamientos que muestran ADN degradado en el gel y se consideran no tipificables por PFGE • Ejemplos: algunas cepas de E. coli O157 y no O157; ciertas serovariedades de Salmonella, como Derby, Livingston, Ohio, Panama, Saintpaul y Cerro (donde todos los aislamientos pueden ser no tipificables) o algunas cepas de ciertas serovariedades tales como Newport, Miami y otras, que generalmente se pueden tipificar por PFGE El agregado de 50 μM de tiourea en el buffer de corrida previene la degradación de ADN

  19. Ejemplo de la Utilización de Tiourea Salmonella Cerro Sin Tiourea Con Tiourea

  20. Muchas Gracias a TODOS

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