VI FESTIWAL NAUKI Fizyka wyjaśnia podstawy zjawisk biologicznych Borys Kierdaszuk Tel.: 55 40 715 Fax: 55 40 001 borys@

1. Uniwersytet Warszawski Wydział Fizyki Instytut Fizyki Doświadczalnej Zakład Biofizyki VI FESTIWAL NAUKI Fizyka wyjaśnia podstawy zjawisk biologicznych Borys Kierdaszuk Tel.: 55 40 715 Fax: 55 40 001 borys@biogeo.uw.edu.pl

2. Jaka dziedzina fizyki bada zjawiska biologiczne? Fizyka, nauka o formach materii (zw. czasami formami pierwotnymi lub uniwersalnymi) właściwych wszystkim prostym i złożonym układom materialnym, o oddziaływaniu tych form oraz ichruchu. (...) bada cząstki elementarne, jądra atomowe, atomy i cząsteczki (wraz z makrocząsteczkami), zbiory makroskopowe cząstek materialnych – ciała stałe (kryształy), ciecze i gazy (...), pola wiążące cząstki – pola elektromagnetyczne, grawitacyjne, ... str. 588 PWN, 1972 (...) dzieli się na szereg działów (f. cząstek elementarnych, f. jądra atomowego, f. atomu, f. cząsteczki, f. ciała stałego,...

3. Związek fizyki z innymi naukami przyrodniczymi doprowadził do powstania dyscyplin pogranicznych – biofizyki, astrofizyki, geofizyki, chemii fizycznej, ... Biofizyka, dział nauki rozwijający się od niedawna, zajmujący się podstawami fizycznymi makroskopowych i molekularnych procesów życiowych (...) oraz oddziaływaniami zewnętrznych czynników fizycznych na te układy. Jest typową międzydyscyplinarną dziedziną nauki. str. 192 PWN, 1972

4. Niektóre składniki molekularnych i makroskopowych procesów życiowych Tkanki Komórki Organizmy zakaźne Cząstki zakaźne Makrocząsteczki Cząsteczki Jony Atomy Protony, neutr., elektrony Mięśnie, . . . K. Mięśniowe, K. Macierzyste,... Bakterie, pasożyty, . . Wirusy, wirusoidy, wiroidy, . . . Białka, kwasy nukleinowe, . . . Aminokwasy, nukleozydy, lipidy +2Ca, +Na, +K, C, N, O, S, H, . . . - +

5. Wszystkie organizmy używają do budowy swoich makrocząsteczek (np. białek, kwasów nukleinowych, ...) tych samych elementów konstrukcyjnych Te same oddziaływania molekularne stanowią o istocie odwracalnych reakcji molekularnych będących przejawem wszystkich form życia: • oddziaływania elektrostatyczne: • F = q1q2/(r2), - stała dielektryczna • wiązania wodorowe: • X-H . . . Y, gdzie X, Y = O, N • oddziaływania van der Waalsa.

6. Celem Biofizyki jest zbadanie fizycznych podstaw procesów życiowych za pomocą metod doświadczalnych, między innymi: rentgenograficznych, spektrofotometrycznych, jądrowego rezonansu magnetycznego, elektronowego rezonansu paramagnetycznego, (. . .) oraz teoretycznych: mechaniki kwantowej cząsteczek elektrodynamiki, termodynamiki, (. . .) Podejście to powinno zaowocować poznaniem wspólnych praw dla różnych przejawów życia

7. Działy biofizyki z pogranicza fizyki, biochemii, fizjologii i anatomii • • Biomechanika • • Fizyka narządu słuchu • • Optyka oka i procesów widzenia • • Fizyka krwiobiegu • • Bioenergetyka (termodynamikaukładów otwartych) • •Procesy życiowe na poziomie molekularnym: - budowa biopolimerów, - przetwarzanie informacjigenetycznej, - kataliza enzymatyczna, - fotosynteza,

8. Intensywny rozwój kontaktów między fizyką i biologią nastąpił z chwilą wejścia zarówno fizyki jak i biologii w badania struktur cząsteczkowych Terminu Biofizyka użyto po raz pierwszy w 1892 r. Szczególnie stymulujący wpływ na zainteresowanie fizyków problematyką zjawiska życia wywarła książka jednego z twórców mechaniki kwantowej, Erwina Schrödingera pt. Co to jest życie – fizyczne podstawy życia komórki. Dynamiczny rozwój biologii w drugiej połowie ubiegłego stulecia zawdzięczamy w znacznym stopniu fizykom.

9. Zwraca uwagę na trudną do wyjaśnieniasprzeczność między konserwatywnym uporządkowaniem procesów życiowych, a prawami fizyki statystycznej ? Wkrótce fizycy przyczynili się do odkrycia mechanizm przekazywania informacji genetycznej. Sprzeczność ta okazała się pozorna, bo w komórce istnieją zespoły enzymów, które zapobiegają niedokładnościom procesu replikacji DNA, oraz inne zespoły enzymatyczne, które naprawiają większość błędów.

10. Decyzję o utworzeniu Katedry Biofizyki na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego podjęto w 1967 r., a jej organizację powierzono Prof. Davidowi Shugarowi Była to pierwsza Katedra Biofizyki na Wydziale Fizyki Jej powstanie było możliwe dzięki poparciu Wydziału Fizyki UW, Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN oraz wielu współpracowników z innych ośrodków naukowych

11. Białko jest jednym z głównych składników żywych organizmów na Ziemi ·Białko (ang. Protein, gr. Proteios – pierwszorzędny) termin wprowadzony przez J.J. Berzeliusa w 1883 r. ·Ponad milion organizmów żyjących na Ziemizawiera około10 miliardów(1010)różnych rodzajów cząsteczek białkowych. ·Wszystkie białka to polimery liniowe. ·Składniki polimerów białkowych: tylko 20 różnych aminokwasów, które różnią się własnościami chemicznymi i fizycznymi.

12. Odmienna ilość i kolejnośćułożenia aminokwasów w liniowych łańcuchach polimerowych stwarza niewiarygodną różnorodność trójwymiarowych struktur Polimer 100-aminokwasowy: Możliwe są 20100 (~10130) różne sekwencje Struktura przestrzenna białka: Sekwencja + Środowisko Struktura Funkcja

13. C Polimer liniowy mieszany N Lokalnie 20 typów ogniw (20 aminokwasów) Pofałdowana Kartka  Helisa  Białko natywne

14. Modele prawoskrętnej helisy  skok 0.15 nm rotacja 100o A B C 0.5 nm

15. Antyrównoległa pofałdowana Kartka 

16. Metody badania struktur przestrzennych białek  I. Krystalografia: ·Rentgenografia i neutronografia: wyznaczenie położenia jąder atomów w białku - Jedna z wielu możliwych konformacji. II. Metody spektroskopowe: ·Wielowymiarowy magnetyczny rezonans jądrowy (NMR): struktura trójwymiarowa ·Spektroskopia absorpcyjna w zakresie podczerwieni (IR): względny udział struktur lokalnych ·Metody teoretyczne: struktura trójwymiarowa. ·Spektroskopia absorpcyjna i emisyjna w zakresie UV i Vis: odległości między cząsteczkami ·Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD): konformacja cząsteczek ·Metody hydrodynamiczne (ultrawirowanie w gradiencie gęstości): masy i kształty cząsteczek

17. Krystalograficzna struktura na poziomie atomowym promienie rozproszone kryształ wiązka Źródło prom. X dyfrakcja rentgenogram Rozpraszanie jest proporcjonalne do liczby elektronów. Fale rozproszone nakładają się. Nakładanie się fal zależy wyłącznie od rozkładu przestrzennego atomów. struktura białka

18. Zasada spektroskopii NMR częstotliwość rezonansowa o = (Ho+Hlok)/2 spin  przejście między stanami spinowymi daje linie NMR E Jądro (J = ½) spin  napromieniowanie wzrost Bo

19. Jednowymiarowe widmo NMR białka wiążącego wapń (kalmoduliny) przesunięcie chemiczne (ppm)

20. Oddziaływanie sąsiednich jąder (efekt Overhausera) umożliwia identyfikację sąsiadujących par protonów i pomiar odległości między nimi protonowe przesunięcie chemiczne (ppm) protonowe przesunięcie chemiczne (ppm) 0.5 nm

21. Porównanie struktury białka (plastocjaniny) wyznaczonej za pomocą rentgenografii(niebieski)i NMR(czerwony) 1 nm

22. Dichroizm kołowy zawiera informację o konformacji białka    (cm –1 M -1) Kłębek statystyczny Długość fali, nm

23. Struktury przestrzenne białek HEMOGLOBINA IMMUNOGLOBULINA DEHYDROGENAZA ALKOHOLOWA IZOMERAZA FOSFPORANÓW

24. Jedną z kluczowych funkcji białek jestaktywność katalityczna Katalizatory białkowe (enzymy) umożliwiają zachodzenie w żywych komórkach reakcji chemicznych, które zachodziłyby w ich nieobecności z niezauważalną szybkością lub nie zachodziłyby w ogóle. Najważniejszymi cechy enzymów są: (a) wysoka specyficzność zarówno wobec typu reakcji jak i związków chemicznych (substratów) ulegających przemianie w produkty, (b) zależność aktywności od fazy rozwoju komórki (organizmu) realizowanej między innymi poprzez oddziaływanie z produktami przemiany materii zwanych inhibitorami.

25. PNP PNP + PNP + Działanie enzymu –fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) nukleozyd purynowy fosforan rybozo-1-fosforan zasada purynowa

26. Dlaczego badamy ten enzym? • Całkowity brak jego aktywności jest przyczyną upośledzenia odporności immunologicznej; jest śmiertelny. • Z drugiej strony, kontrolowane zmniejszenie jegoaktywności może zapobiegać: • odrzutom przeszczepów organów, np. serca, • chorobom autoimmunologicznym, • niektórym rodzajom nowotworów (białaczek), • degradacji aktywności terapeutycznej niektórych pochodnych jego substratów, np. w leczeniu AIDS. • 3. Różnice między enzymami z różnych organizmów (np. bakterii i człowieka) mogą być wykorzystane w ”samobójczej” terapii genowej nowotworów.

27. Struktura enzymu z parami (substrat + inhibitor) w jego miejscach aktywnych substrat inhibitor Poznanie struktury przestrzennej jest jednym z elementów strategii konstruowania bardzo dobrych substratów i inhibitorów

28. Struktura krystalograficzna kompleksu PNP (E.coli) z Formycyną B Asp204 Arg217 W61 H H Ser90 W62 W63 W60 Tyr160 His4 Met180N (neighbour) Phe159 Identyfikacja protonów (tzw. form tautomerycznych) za pomocą badań rentgenograficznych nie jest możliwa

29. forma 1 85% forma 2 15% substrat PNP 0.10 -0.13 -0.51 -0.48 -0.08 0.09 Oddziaływanie PNP z inhibitorem – formycyną A ? Mapa gęstości elektronowej i ładunki netto

30. Zjawisko absorpcji i emisji fotonów   absorpcja emisja Długość fali światła ()

31. Badamy różnicę między absorpcją fotonów substratu i produktu w zależności od czasu

32. Badamy różnicę między emisją fotonów substratu i produktu w zależności od czasu

33. Opis reakcji enzymatycznej: Vmax, Km, Ki

34. Widma absorpcji i emisji PNP i FA Fluorescencja Absorpcja Fosforescencja

35. Względne natężenie fosforescencjidlaformy N(2)-H jest znacząco mniejsze niż dla formy N(1)-H

36. Równowaga tautomeryczna FA w kompleksie z enzymem jest przesunięta na korzyśćformy N(2)-H Kierdaszuk et al., BBA, 1476, 109-128 (2000)

37. Powstanie kompleksu enzym-FA jest przyczyną znacznie większego wzrostu fluorescencji niż fosforescencji FA Włodarczyk et al., 2002

38. Komplementarność badań spektralnych (w roztworze) i krystalograficznych (w ciele stałym) Asp204 Arg217 W61 H Ser90 W62 W60 W63 His4 Tyr160 Met180N (neighbour) Phe159 Spectroskopowa identyfikacja form tautomerycznych usunęła niepewności wbadaniach krystalograficznych

39. Wnioski: • Identyfikacja preferowanej strukturyinhibitora (różniącej się od innych położeniem wodoru), preferowanej przez enzym. • Rozszerzenie wiedzyo mechanizmie działania PNP. • Możliwe wykorzystanie tej wiedzy w racjonalnym planowaniu lekówo lepszej i bardziej selektywnej aktywności terapeutycznej.

40. (Bio)fizyka wobec chorób XXI wieku Na przykładzie chorób neurodegeneracyjnych, (encefalopatii gąbczastych: CJD, vCJD, Kuru, FFI) Mikroskopowy obraz histopatologiczny M. elektronowyM. fluorescencyjny • Podobne objawy: • Utrata percepcji • Otępienie • Degeneracja szarych komórek mózgu

41. Śmiertelne encefalopatie gąbczaste Zwierząt: Scrapie owiec – Leopoldt, Podręcznik Weterynarii, 1759przypadkowa lub zakaźna Gąbczasta encefalopatia bydła (BSE), tzw. Choroba szalonych krów –znana od 1986 r. zakaźna Człowieka: Choroba Creutzfelda-Jacoba (CJD) – 1920 r. zakaźna, dziedziczna lub przypadkowa Nowa wersja CJD (vCJD) – od 1996 r. zakaźna Choroba Kuru – od 1957 r. tylko zakaźna Śmiertelna dziedziczna bezsenność (FFI) tylko dziedziczna

42. Krowy zostały zakażone chorobą podobną do Scrapie owiec, karmą zawierającą resztki chorych owiec 10 000 Zakaz używania resztek zwierząt (owiec) do produkcji pasz 8000 Liczba chorych krów 6000 4000 2000 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Wpływ zakazu używania resztek zwierząt (owiec) do produkcji pasz (1988 r.) na liczbę przypadków choroby szalonych krów (BSE) w Wielkiej Brytanii.

43. Encefalopatie gąbczaste mózgu budziły wątpliwości co do możliwości ich wyjaśnienia za popmocą znanych czynników zakaźnych Dlaczego? Czynnik zakaźny choroby Scrapie owiec: Masa cząsteczkowa ~105, typowa dla białek(!), znacznie mniejsza niż znanych wirusów. Odporny na czynniki degradujące materiał genetyczny (promieniowanie jonizujące, nadfioletowe ~254 nm). Podatny na czynniki chemiczne degradujące białka. Odporny na temperatury do 130 oC, znacznie bardziej niż typowe białka. Alper et al.., (1966) BBRC, 22, 278-284. Griffith (1967) Nature, 215, 1043-1044.

44. Dawka promieniowania wymagana dla likwidacji infekcyjności czynnika zakaźnego zależy od wielkości jego genomu Poxvirus 150 HSV fag  Adenovirus 30 15 d/s DNA Genom d/s DNA (x10-3 par zasad) Scrapie Genom s/s RNA (x10-3 par zasad) Paramyxovirus + + Polyomavirus Flaviviruses 174 + TMV + s/s RNA 3 1.5 + 104 105 106 107 Dawka promieniowania (rad) Jeśli kwas nukleinowy, to o długości < 80 nukleotydów

45. Griffith (1967) sugerował, że czynnikiem zakaźnym może być wyłącznie białko Białko to nazywane jest obecnie PRION (PROteinaciousInfectiousAgent) Białkowy czynnik infekcyjny S.B. Prusiner, 1982 (Nagroda Nobla, 1997)

46. Krowy mogły być zakażone chorobą Scrapie owiec, a człowiek – chorobą BSE krów Zakażenie człowieka chorobą owiec jest raczej wątpliwe, ze względu na różnice między genami kodującymi białko podejrzane o wywołanie infekcji Przykładowe różnice między genami _ Owcy i krowy 7 aminokwasów 3 (%) Myszy i chomika 16 „ 6 Człowieka i krowy 30 „ 12 Człowieka i myszy 28 „ 11 Człowieka i kury 104 „ 41

47. Badania Biotechnologiczne Wyodrębniono białko zakaźne. Dokonano identyfikacji jego genu. Okazało się, że ten sam gen koduje zarówno białko zakaźne jak i . . . . białko normalne (!). Z nieznanych przyczyn, białko zakaźne dodane do roztworu białka normalnego przekształca je w agregaty białka zakaźnego. Podobnie zachowują się białka pomocnicze, tzw. ”chaperones”. Białka normalne i chorobotwórcze nie różnią się pod względem składu chemicznego. Wyjaśnienia infekcyjnych własności należy zatem szukać w różnicach strukturalnych między białkiem normalnym i zakaźnym.

48. Spektroskopia absorpcyjna w zakresie IR Wpływ oddziaływań elektrostatycznych (wiązań wodorowych) na stany oscylacyjne grup C=O i N-H: Białko natywne: C=OH-N Chaotyczny kłębek:brak wiązań wodorowych Agregatybiałka zakaźnego Korzystamy ze spektroskopiiabsorpcyjnejmodelowych struktuyr II-rzędowych: (a) helisa ikartka: 1685 i 1625 cm-1, (b) kłębek,skręt: 1641 i 1672 cm-1, (c) Agregaty białka zakaźnego

49. Dichroizm kołowy zawiera informację o konformacji białka    (cm –1 M -1) Kłębek statystyczny Długość fali, nm

50. Białko Kartka  Helisa  Skręt Kłębek Normalne 3 42 32 23 Zakaźne 43 30 11 16 Najważniejsze wyniki zastosowania spektroskopii absorpcyjnej w podczerwnieni i CD Udział (%) struktur przestrzennych w formie normalnej i zakaźnej białka prionowego Błąd względny: 10 %. Pan K.-M. et al., PNAS, 90, 10962 (1993)