1 / 19

PÖÖRATUD FAASI VEDELIKKROMATOGRAAFIA Tuuli Tamm B-31

PÖÖRATUD FAASI VEDELIKKROMATOGRAAFIA Tuuli Tamm B-31. Vedelikkromatograafia (HPLC). puuduva piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid umbes 60 % kromatograafilistest anlüüsidest Kasutatakse keskkonnaanaüütika või biotehnoloogia labor ites.

isra
Download Presentation

PÖÖRATUD FAASI VEDELIKKROMATOGRAAFIA Tuuli Tamm B-31

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PÖÖRATUD FAASI VEDELIKKROMATOGRAAFIATuuli Tamm B-31

  2. Vedelikkromatograafia (HPLC) • puuduva piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid • umbes 60 % kromatograafilistest anlüüsidest • Kasutatakse keskkonnaanaüütika või biotehnoloogia laborites

  3. Ajaloost • Esimese kromtograafia aparaadi leiutas vene teadlane Tsvett • Kasutatud liikumatu faasi suurus oli ligikaudu 300 umja lahutus võttis aega 12-24 tundi • Analüüsi kiirendamiseks suurendati liikuva faasi voolukiirust, see vähendas aga tunduvalt efektiivsust • Kaasaegse variandi leiutasid Martin ja Snyge (Nobeli preemia 1953 a.)

  4. Vedelikkromatograafia(HPLC) • HPLC mobiilne faas on vedelik (eluent) • Uurimisobjektid: makromolekulid, ioonsed ühendid, looduslikud ühendid

  5. Pööratud faasi vedelikkromatograafia • Pööratud faasi korral on liikumatu faasi polaarsus väiksem kui liikuval faasil • Polaarne mobiilne faas (vesi+modifikaator) ja mittepolaarne statsionaarne faas (C2- C18) • Proovi komponendid elueeruvad oma polaarsusele vastavalt: pööratud faasi korral polaarsuse kahanemise järjekorras

  6. Mehhanism • Pööratud faasi võib vaadelda kui mittepolaarset kilet silikageeli pinnal, kus lahustuvad hästi mittepolaarsed molekulid (näit süsivesinikud). See põhjustab süsivesinike suurema retensiooni kolonnis, samal ajal kui polaarsed molekulid tõugatakse pööratud faasist välja ja nad elueeruvad kiiresti läbi kolonni.

  7. Aparatuur

  8. Eluent • Eluendiks on tavaliselt orgaaniliste lahustite segu või soolade vesilahus, mida hoitakse klaaskolvis või polüetüleenpudelis. Eluendi valik sõltub analüüsist. Tavaliselt sisaldab eluent lahustunud gaase, mis kõrge rõhu all moodustavad mulle. • Lahustunud gaaside eluendist eemaldamiseks kasutatakse selliseid võtteid nagu eluendi keetmine või töötlemine ultrahelivannis. Heeliumi barboteerimine (läbipuhumine) eluendist enne analüüsi algust.

  9. Pump • Edasi-tagasi liikuva kolviga pumbad, mis varustavad kolonni eluendiga kindla sagedusega • Pump koosneb ekstsentrilisest ajamist, safiirkolvist ja kahest rubiinkuulidega ventiilist, mis avavad või sulgevad eluendile pääsueluendianumasse ja kolonni • Pump toidab kolonni eluendiga perioodiliselt ja detektori signaalis on näha vastava sagedusega pulsatsiooni. Selleks, et pulsatsiooni minimeerida, kasutatakse kromatograafias tavaliselt kahte pumpa, mis töötavad vastasfaasis

  10. Pump • Kolb • Tihendid • Ventiilid • Ekstsentriline pöörlev ajam • Eluendi kamber

  11. Proovi sisestamine • Vedelikkromatograafias kasutatakse vastavalt 6 avaga kahepositsioonilist klappi. • Klapi laadimisasendis täidetakse aas prooviga kasutades mikrosüstalt. Analüüsi alustamiseks viiakse klapp teise asendisse ja eluent kannab aasas oleva proovi kolonni.

  12. Kolonn • Kolonniks on vedelikkromatograafias tavaliselt roostevabast terasest metalltoru välisdiameetriga 6,4 mm (1/4 tolli) ja sisediameetriga 4,6 mm. Kolonni pikkus on kuni 25 cm. Kolonni sisepind on siledaks poleeritud.

  13. Kolonni täidis • Kolonni täidiseks on vedelikkromatograafias silikageel (amorfne tahke valget värvi poorne materjal) • Vedelikkromatograafias kasutatav silikageel koosneb ebaregulaarse kujuga osakestest läbimõõduga 3-4 um. • Kolonni täitmiseks valmistatakse sobivas lahuses silikageeli suspensioon, mis siis kõrge rõhu all kolonni pumbatakse

  14. Detektor • UV-detektor • See on modifitseeritud spektrofotomeeter, mille küvetiks on väike läbivoolurakk, mis on asetatud spektrofotomeetri kiirte teele • Fluorestsentsdetektor

  15. Liikuv ja liikumatu faas • Liikuv faas osaleb aktiivselt lahutusprotsessis ja selle õigest valikust sõltub analüüsi tulemus • Liikumatuks faasiks on silikageel, millega on seotud keemiliselt seotud pikad (n=18) alküülahelad • Pööratud faasi korral on liikumatu faasi polaarsus väiksem kui liikuval faasil

  16. Kasutusalad • Kasutatakse nõrga polaarsusega neutraalsete molekulide puhul, liikuvaks faasiks on vesilahused • Alifaatsete või aromaatsete rühmadega molekulide lahutamisel • Segu analüüsil, mille komponentide polaarsus varieerub suurtes piirides (gradientelueerimine)

  17. Pööratud ja normaalfaasi erinevus

  18. Plussid • Saab kasutada segu analüüsil, mille komponentide polaarsus varieerub suurtes piirides • Suur lahutatavate ühendite hulk • Liikuva faasi odavus, lihtsus

  19. Miinused • Kasutatakse ainult neutraalsete molekulide korral • Analüüsi optimiseerimine on keerukas, kuna ka mobiilne faas osaleb lahutusprotsessis • Jäägid

More Related