Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27 Aprile 2007

1. Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27 Aprile 2007 Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene pesanti delle Ig umane I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32 Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento e class switch. Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione), switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo, per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari.

2. Come funziona il controllo “cis” della catena pesante delle Ig • Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte) • servono da segnale per i fattori ed enzimi per : • i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico • la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti sterili) che nella plasmacellula e della memoria • interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che fungono da secondi messaggeri • con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma umano e di topo

3. Importanza della regolazione delle Ig Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione primaria in se (in questo caso le Ig) Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da questa prima funzione Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc. Altri sistemi correlati (snc, digerente …) I - interazione col sistema immune nelle funzioni fisiologiche e patologiche

4. Chi dice al linfocita quale “switch” fare E se lo “switch” è casuale quale è il segnale selettivo per cui nei distinti distretti restano i linfociti che producono un certo tipo di Ig Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed effetti della trascrizione delle Ig

5. Cosa si può chiedere Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso nessuno dei due. Per ora cerchiamo dei possibili esecutori Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla organizzazione della regione regolatrice e quindi sul genoma direttamente sul locus delle Ig Forse è un quadro intermedio con responsabilità del settore “risposta umorale” A monte e a valle della trascrizione delle Ig cosa c’è e quali metafunzioni svolge

6. L’organizzazione genomica Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle catene pesanti Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo dell’enhancer centrale del complesso regolatore. 2 americani ed 1 francese Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14 q32, anche le catene leggere hanno la loro importanza relativa

7. Il sito delle Ig umane è poco diverso dal topo vedi la figura della mappa del locus Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è presente la duplicazione dei 4 geni delle regioni costanti Ig3, Ig1, Ig, Ig1 Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR

8. geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili * regione duplicata regione duplicata a2  4  2 1  1 3  V D J *  3 enhancers 3 enhancers enhancer 5’ Chromosome 14q32 strutture regolatrici delle catene pesanti delle Ig umane reg. variab.* telomero

9. Strutture regolative della trascrizione Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’ Somatic hypermutation (SHM) class switch recombination (CSR) 3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene V Sequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS) interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (CH) e nelle IgH l’enhancer intronico (iE) L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in linee cellulari con delezioni di iE in cui c’era trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la trascrizione

10. bibliografia Henderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, 163-200 Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit. 148-163, Lippincott-Raven, Philadelphia Stavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 127-168 Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, 165-196 Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, 73-80 Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,317-345

11. SA2.5 IgH3’EC-1 A2R Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 H* H B E B B B H B H H U 14 U9 1 R4 R6 Ua1 U3 U5 R3 R3r U5r Ua4 R5 Alu LTR ELK2 U1 R1 R2 U4 U6 U7 U8 U6r Ua2 Ua3 R5 U11 U12 U16 U13 K10 retrovirus U15 Ua5 U10 U2 A HS3 HS1,2 HS4 Y14407 AL928765 U64453 X76785 AL928767 CHR77 (35.616 kb) Chromosome 14  4  2 1  1 2 3   Telomere B IgH3’EC-2 SF AL928742 (40 kb) Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 H H B B H B E B B H U9 Ub4 R6 Alu LTR 2 R1 U6r R4 Ub3 R5 Ub1 Ub2 R3 U 8r U5 U4-5 U 3 U13 U14 U15 U16 U2 U4 U7 U10 U11 U12 R3r R5 U1 U7r U5r R3 U6 HS3 HS1,2 HS4 SA2.5 A2R A2F

12. A B Selective amplification of HS1,2-A downstream Ca1 (IgH3’EC-1) Selective amplification of HS1,2-B downstream Ca2 (IgH3’EC-2) Poly A site Poly A site B H H* B H HS 3 HS 3 U8 r U7r R3 R3 R3r Ub2 U5 U1 R1 Ub1 R3 R3 r Ua1 U5 U8 U1 U3 2m U2 U6 U4-5 U6r U5r R4 U4 U6 U7 1m R1 R2 UU 3 4 HS 1,2 U2 HS 1,2 E B H E B B B B B SA2.5 5402 bp HS1,2 HS 3 4420 bp HS1,2 A2R SA2.5 A2R A2F EcoRI HS1,2 ALLELE 1A D3Rev P3Frw EcoRI ALLELE 2A EcoRI EcoRI HS1,2 ALLELE 3B ALLELE 3A P3Frw EcoRI EcoRI D3Rev ALLELE 4B ALLELE 4A Core of enhancer HS1,2 14bp 16bp 20bp Repeated element - 38 bp Internal spacers External element - 31 bp External element -17 bp Conserved sequence Unit

13. CM11 CM 4 CM 5 ALLELE 2 ALLELE 3 ALLELE 4 ALLELE 1 Sites for : AP4; E47; MYOD; mE5 Sites for : CMYB Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50) Sites for : NF-kB (Q6) A M1 M2 G A B G A B G A B 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 38bp Rp 17bp El. END HS1,2 17bp El. B ALLELE 1A CORE enhancer 14bp Sp. ALLELE 2A 16bp Sp. ALLELE 3A 31bp El 20bp Sp. ALLELE 3B ALLELE 4A ALLELE 4B Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)

14. HS3A HS1,2 HS3B HS4 mouse Ig heavy locus V D J a   b   L C R human chromosome 14 q 32 HS3 HS1,2 HS4 HS3 HS1,2 HS4   3 1  1 2 4  a2 telomere    copia 1 copia 2 LCR (nel topo 4 enhancers)IgH3’EC-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)

15. Y14407 AL928765 U64453 X76785 AL928767 CHR77 (35.616 kb) IgH3’EC-1  4  2 1  1 2 3   Telomere IgH3’EC-2 SF AL928742 (40 kb) cluster della catena pesante delle Ig Chromosome 14

16. PLASMACELLULE Cellule B proliferanti IgG2a o IgG3 IFN-g Cellula B attivata (centroblasto) IgA o IgG2b TNF-b IL-2; IL-4; IL-5; IL-4 IgE o IgG1 Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; IL-2; IL-4; IL-5; IgM Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-g; TNF-b; Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)

17. LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig Locus catena leggera l Cromosoma 22 Locus catena leggera k Cromosoma 2 Locus catena pesante Cromosoma 14

18. ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE Locus Catene leggere V-J processing VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana Locus Catene pesanti D-J processing V-DJ processing VDJ riarrangiato VDJ riarrangiato CELLULE B Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

19. Locus Catene leggere VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. Le catene m prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico a Cg, Ca o Ce. Ipermutazione somatica Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. Locus Catene pesanti VDJ riarrangiato Catene m prodotte in forma secreta. CELLULE B Cellule B attivate Centrociti Plasmacellule Cellule Memoria Plasmacellule ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

20. VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J Switch region: V(D)J m d g3 g1 2b 2a e a • Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb Ricombinazione class switching (CSR) IgM • Il filamento non stampo è ricco in G 2a m V(D)J e a • Sm, Sa ed Se hanno un repeat di 5 bp. Sg ha un repeat di 49 bp. d 2b IgE g3 g1 Risultato dello switch Cricolo exciso Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

21. Trascrizione regione S A B C D E F AID? AID? CSR ricombinasi? Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili RNA editing ? Riconoscimento delle regioni S accessibili Formazione di strutture secondarie (R loop?) A A C C D F D F E E B B Formazione di breaks al DNA CSR ricombinasi? Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA A C A C B Riparazione dei breaks B AID? AID? una regione S Switch su un altro cromosoma due regioni S c-myc S S S S A A B C A B E F traslocazione Delezioni intra-switch Class switching recombination 1 2 Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).

22. La risposta immunitaria cellulo mediata (linfociti T) umorale (non dell’umore) I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria (immunita’ acquisita) specifica. L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig). Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1 Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico.

23. A che serve lo studio della struttura? (aforismi) La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la fisiologia. La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del sistema. Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con la maturazione dei linfociti Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali

24. Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 sub-telomerico) Mappa della catena pesante delle IG Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad una sequenza costante. Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica, IgD funzione ancora non del tutto chiara. V D J m d g3 g1 ye a1 yg g2 g4 e a2 cluster della catena pesante delle immunoglobuline

25.  d g3 g1 ye yg g2 g4 e a2 a1 TOPO  d g3 g1 g2b g2a e a 5’ 3’ LCR a 350 kb SacII NaeI NaeI NaeI Eag I Eag I Eag I Eag I 120 Kb 180 Kb 130 Kb VH j   3 1  1 2 4  2 yg LCR-B LCR-A MluI MluI 50 kb Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC nell’uomo e nel topo UOMO 3’ 5’ LCR-B LCR-A

26. Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento Confronti in silicio : omologie di struttura ricerca cloni EST Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione) Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primati Conservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti) I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.) Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig Studio della diversa funzionalita’ Studio di espressione dei markers della maturazione Studio della induzione della maturazione e switch in vitro

27. Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico Le attivita’ coinvolte in questo modello sono: a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia) b) la proliferazione cellulare (linfomi) c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e malattie autoimmuni) Finalita’ Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”. Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????