VYUŽITÍ EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR

VYUŽITÍ EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR • Studium základních problémů fyziologie rostlin • výživa rostlin • působení fyzikálních faktorů • působení růstových regulátorů • organogeneze, embryogeneze • Množení rostlin • Ozdravování rostlinného materiálu • Produkce sekundárních metabolitů • Biotransformace • Produkce umělých semen • Šlechtění rostlin

Studium základních problémů fyziologie rostlin • Indukce tvorby elementů cévního systému Elementy cévního systému bloček + auxin • Tvorba xylémových buněk v suspenzních buněčných kulturách (hrách,salát) požadavek : auxin, cytokinin, cukr, nutná syntéza NA, není nutné buněčné dělení !

Studium základních problémů fyziologie rostlin • Rediferenciace mezofylových buněk (Zinnia elegans) 96 hod Mezofylové buňky Xylémové buňky NAA + BA A – izolované mezofylové buňky B – kultivované buňky 96 h po izolaci C - diferencovaná xylémová buňka Lacayo et al., 2010 • Signální účinek hladiny sacharidů - buněčné kultury šeříku (IAA): Lze studovat: • povahu signálu, který proces spouští • modulování signálu • vliv na syntézu makromolekul 1% sacharózy …………………..xylém 2% sacharózy …………………. xylém + floém 3% sacharózy…………………..xylém + floém 4% sacharózy………………….. xylém + floém Groover and Jones, 1999

Studium základních problémů fyziologie rostlin Systém tenkých vrstev (TCL- thin cell layers) • Kultury rostlinných explantátů vhodné pro studium procesů morfogeneze • Diferenciace mikrospor = unikátní nástroj studia dělení buněk + diferenciace, nezralý gametofyt  sporofyt (více než u 200 druhů zvládnuto: mikrospora  rostlina) • Řízená morfogeneze na segmentech pomocí změn poměru auxin : cytokinin • Studium kompetence buněk k navození organogeneze v závislosti na poloze Gradient květní kapacity • Ovlivnění morfogeneze působením fragmentů polysacharidů buněčné stěny • inhibice auxinem stimulovaného prodlužování segmentů stonku • inhibice tvorby kořenů na médiu indukujícím tvorbu kořenů (TLC) • indukce vytváření květních pupenů Oligosacharidy z buněčné stěny = signální molekuly

v G1/S přechodu KRP cytokinin CDK A CDK A CDK A + S CYC D CYC D CYC D v G2/Mpřechodu P P P P P CDK A/B M CYCA/B WEE1 ? cytokinin P P CDK A/B CDK A/B CDK A/B CYCA/B CYCA/B CYCA/B • Studium regulace buněčného cyklu Cytokinin působí na buněčný cyklus:

CAK P CDC25 P Regulace G2/M u kvasinky S. pombe CKI CKI CAK P G2 cyklin CDK G2G2/MM

CDC25 CDC25 CDC25 P P P CDC25 P G2 G2/MM Regulace G2/M u kvasinky S. pombe CKI CAK P G2 cyklin CDK

transformant C Transformant s vneseným genem SPcdc25 z S. pombe Organogeneze de novo na stonkových segmentech Pupenů Kořenů cytokinin auxin cytokininauxin 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA 0,1 mg/l BAP + 3 mg/l NAA kontrola • k posílení tvorby pupenů • k omezení tvorby kořenů exprese genu cdc25 vede

kontrola transformant G2/M P P P P P M kontrola transformant „CDC 25“ cytokinin cytokinin P P CDK A/B CDK A/B CDK A/B CYCA/B CYCA/B CYCA/B Organogeneze na médiu bez růstových regulátorů Exprese genu cdc25 vede: • ktvorbě pupenů de novo bez aplikace cytokininů Buněčné suspenzní kultury Exprese genu cdc25 vede: • změně orientace buněčného dělení a tvaru buněk

Množení rostlin • Ozdravování rostlinného materiálu • Produkce sekundárních metabolitů • Biotransformace • Produkce umělých semen • Šlechtění rostlin

Množení rostlin : 1) generativní 2) vegetativní in vivo • pomalé množení • malé nasazení semen • často obtížné • dlouhý generativní cyklus • u řady druhů nemožné • rychlá ztráta klíčivosti • infekce • dormance semen • genetická heterogenita • semena bez patogenů • snadné skladování, transport, manipulace • rychlý cyklus množení • genetická uniformita • velký počet jedinců v krátkém čase • slabá genetická stabilita • genetická uniformita • postupná ztráta regenerační kapacity • u druhů, kde in vivo není možné • aseptická kultivace, pracnost • bez patogenů • problémy s přenosem do ex vitro • nezávislost na vegetačním období • možnost množení: haploidi, sterilní, mutanti, aneuploidi, zachování specifické genové kombinace • Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení Generativní množení Nevýhody Výhody Výhody Nevýhody Vegetativní množení in vitro Pečlivým výběrem podmínek a postupů lze minimalizovat

Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množeníin vitro Zahrnuje: • meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) • úžlabní odnožování • somatickou embryogenezi • regeneraci odventivních orgánů na řízcích • regeneraci z buněčných kultur • tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách • regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Množení rostlin • Ozdravování rostlinného materiálu • Produkce sekundárních metabolitů • Biotransformace • Produkce umělých semen • Šlechtění rostlin

Množenírostlin • Ozdravování rostlinného materiálu • Produkce sekundárních metabolitů • Biotransformace • Produkce umělých semen • Šlechtění rostlin

Ozdravování rostlin • Většina rostlin – systematická infekce, rostlina nemusí zahynout --- omezení růstu  snížení výnosu, snížení kvality plodů. --- infekce bakteriemi, houbami, viry • Odstranění patogenů důležité pro: • zvýšení výnosu, kvalitu produktů • možnost pohybu rostlinného materiálu přes hranice • semeno viruprostá rostlina, ale sexuálně množené rostliny -- genetická variabilita • někdy není napadena celá populace  výběr zdravých jedinců  vegetativní množení • často napadena celá populace  problém č. 1 : získat zdravou rostlinu  vegetativní množení • Nerovnoměrné rozložení patogena Apikální meristémy často zcela viruprosté či s nízkou koncentrací Koncentrace obvykle vzrůstá se vzdáleností od apexu Důvody nerovnoměrného rozšíření virů v rostlině: • pohyb virů po rostlině cévním systémem • vysoká metabolická aktivita apexu nedovoluje replikaci virů • vysoká hladina endogenních auxinů v apexu inhibuje multiplikaci virů

 poškození patogena zabití patogena  Poškození patogena zabití patogena Zóna terapie Zóna terapie Zóna růstu Zóna růstu ??!! °C °C Způsoby aplikace • horkou vodou – dormantní pupeny • horkým vzduchem - aktivně rostoucí výhony • teploty 35-40°C, trvání několik min až několik měsíců, pomalé zvyšování • teploty, střídání nízkých a vysokých teplot Nevýhody termoterapie Necitlivost virů k vyšším teplotám X citlivost rostlin Ozdravování rostlin Termoterapie - eliminace teplem

Ozdravování rostlin • Chemoterapie Chemoterapie celých rostlin často nevede k cíli … ošetření explantátových kultur in vitro lepší výsledky Přítomnost R.R. snižuje výskyt virů • Eliminace virů kultivací tkáňových kultur Ne všechny buňky tkáňové kultury nesou virus • replikace virů nestačí držet krok s dělením buněk • některé buňky jsou rezistentní (mutace, rezistentní buňky již v mateřské rostlině) Ozdravení pomocíkultivace explantátů • Kultivace vzrostných vrcholů (apikální meristem + 1-3 listová primordia)  větší šance na přežití • Kultivace meristemových kultur  větší šance na získání bezvirózní rostliny, • Kryoprezervace vzrostných vrcholů precizní „výběr“ meristematických buněk Ne vždy je meristem viruprostý  kombinace metod termoterapie a kultivace apikálních meristemů • působit na mateřskou rostlinu • působit na explantát • postup opakovat

Ozdravování rostlin Testování úspěšnosti eliminace • sledování příznaků choroby • indikátorové rostliny • sérologické testy • elektronmikroskopické sledování Uchovávání bezvirózních rostlin • Nebezpečí nové infekce - množení ve sklenících nebo v oblastech • s  výskytem patogena • Zvýšená citlivost, křížová ochrana, řízená reinfekce Viry Cílená infekce X X Ozdravení X X Rostlinná buňka • Materiál pro studium interakce virus-rostlina Význam eliminace virů • Zlepšení výnosu a kvality potravin • Splnění požadavku pro vývoz plodin

Př.: Bezvirózní rostliny- česnek Riziko : vegetativní množení ozdravení in vitro meristemové kultury Solimanetal., 2011 Ozdravování:  30-40% přežití , 65 % bezvirózní chemoterapie 205 µM Ribavirin  100% přežití , 20-30% bezvirózní termoterapie 32°C - 1 týden + 36°C dva týdny + 38°C tři týdny  20-30 % přežití 60-70 % přeživších – bezvirózní  Po 4 vegetačních obdobích o 20 % vyšší výnos Perottoetal., 2010 Ramírez-Malagónetal., 2006

VYUŽITÍ EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR