L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato:

1. L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga GASCROMATOGRAFIA (CAS-3b) Giorgio Bonaga

2. b) LIQUIDO DI PARTIZIONE • Le caratteristiche che dovrebbe avere il liquido di partizione ideale sono: • bassa tensione di vapore (< 0,1 torr = 10 Pascal) per evitare lo spurgo (“bleeding”) del liquido di partizione sul detector che produrrebbe un rapporto signal/noise sfavorevole (il problema non c’è se si impiegano colonne a fasi legate e/o a legami reticolati); • stabilità termica alle temperature di esercizio della colonna; • inerzia chimica perché il liquido deve interagire con i soluti e non reagire; • proprietà solvente nei confronti dei soluti, per fornire appropriati valori del fattore di capacità k’ e del fattore di selettività a . • Nella GC è fondamentale la scelta del sistema soluto/liquido di partizione, per la validità del principio generale “il simile scioglie il simile”. • È pertanto utile una classificazione dei soluti e dei liquidi di partizione in base alla loro polarità. Sebbene abbia valore soltanto indicativo, l’elencoè utile per razionalizzare l’accoppiamento polarità dei soluti/polarità del liquido di partizione (1. moltopolare/molto polare, 2. polare/polare, 3. poco polare/ moderatamente polare, 4. non polare/non polare). Giorgio Bonaga

3. Giorgio Bonaga k d RICHIAMO DI CHIMICA PREVISIONE DELLA POLARITA’ DELLE MOLECOLE PREMESSA: la polarità dei legami dipende dalla differenza di elettronegatività (DE, secondo Pauling) degli atomi che li formano: 1. Legame ionico La perdita di un (o più) elettrone da parte di un atomo e il corrispondente acquisto di un (o più) elettrone da parte dell’altro atomo (DE > 1,5, pari ad una % di carattere ionico > 50%) produce una coppia di controioni che si attraggono nel rispetto della legge di Coulomb. - + F = ± kq+. q- d2 (k = costante dielettrica, dipende dalla densità del mezzo che separa le cariche)

4. 2. Legame covalente non polare Tra due atomi uguali o tra due atomi con DE < 0,4 si forma un orbitale molecolare simmetrico (o quasi simmetrico) con distribuzione uniforme della densità elettronica. 3. Legame covalente polare Tra due atomi diversi con 1,5 > DE > 0,4 si forma un orbitale molecolare asimmetrico con separazione del baricentro delle cariche positive (d+) dal baricentro delle cariche negative (d-). d- d+ Giorgio Bonaga

5. La polarità delle molecole dipende dalla risultante della polarità dei singoli legami presenti nella molecola, ovvero dalla combinazione tra la polarità dei legami e la simmetria molecolare. La polarità della molecola si esprime con il momento dipolare m (in Debye = 3,33 .10-30 coulomb . m), cioè con un vettore il cui modulo è: m = d+. r dove: d+ = valore della carica (parziale) r = distanza tra il baricentro delle cariche parziali positive e delle cariche parziali negative Una MOLECOLA E’ POLARE se le separazioni dei baricentri delle cariche elettriche NON SONO BILANCIATE. Una MOLECOLA E’ NON POLARE se i suoi legami NON SONO POLARI o se le separazioni dei baricentri delle cariche elettriche SONO BILANCIATE. d+ d- r Giorgio Bonaga

6. PROCEDURA PER LA PREVISIONE DELLA POLARITA’ DELLE MOLECOLE • ► Step 1 • Scrivere le ragionevole formula di Lewis della molecola (stereochimica e stereoelettronica) • ►Step 2 • Identificare di ciascun legame il carattere polare (DE > 0,4 < 1,5 tra gli atomi ) o il carattere non polare (DE < 0,4 tra gli atomi) • se non ci sono legami polari la MOLECOLA E’ NON POLARE • se ci sono legami polari passare allo Step 3 • ►Step 3 • Se c’è una solo atomo centrale, esaminare gli elettroni che lo circondano: • se non ci sono coppie di elettroni di non legame sull’atomo centrale e se tutti i legami dell’atomo centrale sono uguali, la MOLECOLA E’ NON POLARE • se l’atomo centrale ha almeno una coppia di elettroni di non legame e se gli atomi o i gruppi legati all’atomo centrale non sono tutti uguali, con elevata probabilità laMOLECOLA E’ POLARE. • Passare allo Step 4. • ►Step 4 • Disegnare la geometria della molecola Giorgio Bonaga

7. ► Step 5 • Determinare la simmetria della molecola usando i seguenti criteri: • rappresentare i legami polari con una freccia vettoriale puntata verso l’atomo più elettronegativo, con una lunghezza proporzionale alle polarità relative dei differenti legami • valutare se la disposizione delle frecce è simmetrica o asimmetrica: • se la disposizione è simmetrica e le frecce sono di uguale lunghezza, laMOLECOLA E’ NON POLARE • se le frecce sono di differente lunghezza e se non si bilanciano tra loro (con il parallelogrammo delle forze, ad esempio) la MOLECOLA E’ POLARE • se la disposizione è asimmetrica, la MOLECOLA E’ POLARE • ESEMPI • Adottando la procedura appena illustrata prevediamo la polarità di: • biossido di carbonio • acqua • tetracloruro di carbonio • triclorofluorometano • diclorometano • acido cianidrico Giorgio Bonaga

8. 1. BIOSSIDO DI CARBONIO (CO2) d-d+d- 2,55 3,44 .. .. m = 0 O C O .. O C O .. DE(O-C) = 0,89 2. ACQUA (H2O) 3,44 .. .. d- d+d+ O H H O H H m = 1,85 DE(O-H) = 1,24 m 2,20 3. TETRACLORURO DI CARBONIO (CCl4) .. 3,16 d- .. .. Cl C Cl Cl Cl C Cl Cl d+ 2,55 m = 0 DE(Cl-C) = 0,61 d- Cl Cl d- d- Giorgio Bonaga

9. 4. TRICLOROFLUOROMETANO (CFCl3) d- 3,98 .. F C Cl Cl m .. .. F C Cl Cl d+ 2,55 m = 0, 45 DE(Cl-C) = 0,61 DE(F-C) = 1,43 d- Cl Cl 3,16 d- d- 5. DICLOROMETANO (CH2Cl2) 3,16 .. d- .. .. Cl C H Cl Cl C H Cl m d+ 2,55 m = 1,14 DE(C-H) = 0,35 DE(Cl-C) = 0,61 H 2,20 H d- 6. CIANURO DI IDROGENO (HCN) m 2,20 2,55 3,50 m = 2,90 DE(C-H) = 0,35 DE(N-C) = 0,95 .. .. H C N H C N Giorgio Bonaga

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12. CRITERI GENERALI PER STABILIRE LA POLARITA’ DEI POLISILOSSANI (SILICONI: XE, XF, OV, SE, HP) polarità del liquido di partizione metil- CF3CH2CH2 trifluoropropil- n m fenil- polisilossano cianopropil- Giorgio Bonaga

13. Giorgio Bonaga POLARITA’ DEI LIQUIDI DI PARTIZIONE

14. VALUTAZIONE DEL LIQUIDO DI PARTIZIONE 1. INDICE DI RITENZIONE DI KOVATS Dal momento che il fattore di capacità k’ è un parametro che dipende da numerosi fattori (tipo di liquido di partizione, loading, temperatura, ecc.), esso è valido soltanto se si riproducono le stesse condizioni con le quali è stato calcolato, eventualità che a volte non è possibile. Questa difficoltà oggettiva può essere superata introducendo una scala relativa dei tempi di ritenzione, mediante la quale si possono confrontare i valori di k’ ottenuti in condizioni gascromatografiche diverse. Questa scala convenzionale, che non si basa sui tR effettivi di una serie omologa di n-paraffine, si ottiene moltiplicando per 100 il numero di atomi di carbonio di ciascuna di esse. C2:0 C3:0 C4:0 C5:0 C6:0 10” 16” 28” 40” 62” tR 200 300 400 500 600 RI Giorgio Bonaga

15. log t’R(A) – log t’R(x) log t’R(x+1) – log t’R(x) La scala convenzionale è la scala degli indici di Kovats (I). Una sostanza con I = 450 ha un comportamento gascromatografico corrispondente (in modo convenzionale) ad una struttura idrocarburica con un numero frazionato (= 4,5) di atomi di carbonio. Se si cambiassero tutti i parametri gascromatografici (lunghezza colonna, temperatura, flusso, ecc.), mantenendo però la stessa fase stazionaria, i tR effettivi della serie di n-paraffine sarebbero completamente diversi da quelli precedenti. Se, però si assegnano alle n-paraffine i valori convenzionali 300, 400, 500, ecc., anche la sostanza avrebbe l’ indice di ritenzione precedente. Il valore dell’indice di ritenzione di Kovats per una sostanza A si ricava dai tempi di ritenzione corretti t’R (= tR–t0) dei due idrocarburi omologhi (x e x+1) e della sostanza A: I = 100 .x + 100. Esiste una relazione logaritmico-lineare tra il tR e il numero di atomi di carbonio dei membri di una serie omologa, come si può verificare nel diagramma su carta semilogaritmica per la serie degli n-alcani (retta A) e la serie degli n-alcoli (retta B). Giorgio Bonaga

16. 1000 900 B 800 700 600 500 400 300 200 A log tR 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 numero di atomi di carbonio Giorgio Bonaga

17. unknow 20,6 n-butano 25,0 propano 16,2 29,8 t0 1,2 9,4 12,9 6,1 33,1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 tR (s) log (20,6-1,2) – log (16,2-1,2) I (unknow) = 100 . 3,0 + 100 . = 356 log (25,0-1,2) – log (16,2-1,2) ESEMPIO L’analisi GC ha fornito il tracciato seguente, con indicati i tempi di ritenzione dei picchi. Qual è l’indice I della sostanza incognita ? Giorgio Bonaga

18. L’indice di Kovats è utile anche per determinare la polarità relativa di 2 fasi stazionarie diverse, attraverso il calcolo della DI di una sostanza A (ad esempio n-ottanolo) nei due gascromatogrammi (vedere costanti di Mc Reynolds). x A x+1 COLONNA 1 I = 850 800 850 900 COLONNA 2 I = 825 x A x+1 DI = 825-850 = -25 La colonna 2 è meno polare della colonna 1 e il n-ottanolo (A) è meno trattenuto dalla fase stazionaria. 800 825 900 Giorgio Bonaga

19. x A x+1 COLONNA 1 I = 850 800 850 900 x A x+1 COLONNA 2 I = 875 800 875 900 DI = 875-850 = +25 La colonna 2 è più polare della colonna 1 e il n-ottanolo (A) è più trattenuto dalla fase stazionaria. Giorgio Bonaga

20. 2. COSTANTI DI MCREYNOLDS Poiché nella GC il gas di trasporto non partecipa al processo di partizione, le differenze nella ritenzione dipendono dalle solubilità relative dei composti nella fase stazionaria liquida. Nella scelta della fase stazionaria la regola più semplice è che “simile scioglie simile”. La polarità e la selettività delle fasi stazionarie verso specifici gruppi funzionali presenti nelle molecole dei soluti possono essere valutate confrontandole con composti standard che contengano gli stessi gruppi funzionali. Il modello più usato è quello delle costanti di Rohschneider-McReynolds, dette più comunemente costanti di McReynolds, che si basa sul confronto (D) dell’indice di Kovats di un composto standard su una certa fase stazionaria con l’indice di Kovats dello stesso composto su una fase stazionaria di riferimento non polare, lo squalano (C30H62). Il dato fondamentale fornito dalle costanti di McReynolds è: tantopiù elevate sono le costanti di McReynolds tanto maggiori saranno i tempi di ritenzione dei composti, ovvero tanto maggiore è la polarità della fase stazionaria. Giorgio Bonaga

21. Dei 10 composti standard impiegati originariamente per determinare le costanti di McReynolds, oggi si utilizzano soltanto quelli di seguito riportati: ESEMPIO Giorgio Bonaga

22. Più elevato è il valore della somma delle costanti di Mc Reynolds tanto più elevata è la polarità della fase liquida e maggiori saranno i tempi di ritenzione dei cinque composti standard. ESEMPIO D: Quale fase stazionaria di quelle elencate è più idonea a trattenere maggiormente i chetoni rispetto gli alcoli ? R: Quella che ha un valore elevato di z’ e basso di y’, valori deducibili dalla tabella precedente e corrispondenti alla OV 210. Giorgio Bonaga

23. - 1 tR(x+1) - tR(x) SN = w1/2(x) w1/2(x+1) + 3. NUMERO DI SEPARAZIONE È una parametro che caratterizza la risoluzione di una colonna gascromatografica. Il numero di separazione (Separation Number = SN) indica il numero di picchi gascromatografici che possono collocarsi tra i picchi di due composti consecutivi di una serie omologa con x e x+1 atomi di carbonio, ad una risoluzione prestabilita R = 1,177 (la risoluzione nella quale la sovrapposizione dei 2 picchi è < 1%). Il valore di SN si calcola in base alla formula: R = 1,177 x x +1 w1/2(x) w1/2(x+1) Giorgio Bonaga

24. - 30’’ 20’’ SN = - 1 = 0 5 + 5 - - 50’’ 60’’ 20’’ 20’’ SN = - 1 = 2 SN = - 1 = 3 5 + 5 5 + 5 R = 1,5 SN = 0 R = 3 SN = 1 Giorgio Bonaga - 40’’ 20’’ SN = - 1 = 1 5 + 5 0 20 40 tR 0 20 40 tR R = 4,5 SN = 2 R = 6 SN = 3 0 20 40 60 tR 0 20 40 60 tR

25. √ N + 1 0,1 2 = 0,425 2,1 √ N Il numero di separazione SN fornisce informazioni sull’attività del supporto nella cromatografia di adsorbimento e sullo spessore della fase stazionaria nella cromatografia di partizione. Si può anche definire la risoluzione R come il numero di picchi che possono stare nello spazio compreso tra i due picchi successivi di una serie omologa. Il SN è anche correlato all’efficienza della colonna dall’equazione: L’equazione consente anche di calcolare, per un valore già calcolato di SN, il numero di piatti teorici necessari per separare 2 picchi che hanno una certa selettività a. ESEMPIO Una colonna ha un SN = 2. Qual è il numero di piatti teorici che deve avere la colonna per separare due sostanze con selettività a = 1,1 ? a - 1 √N + 1 SN = 0,425 a + 1 2 2 1 = N = 50 2 = 2500 0,02 Giorgio Bonaga

26. Giorgio Bonaga • TEST DI GROB • Consente di valutare l’efficienza di una colonna gascromatografica capillare e di caratterizzare alcuni parametri (assorbimento, acidità/basicità, spessore liquido di partizione). La soluzione test è una miscela di 13 componenti a concentrazioni note.

27. Giorgio Bonaga 4. decanoato di metile 5. undecanoato di metile 6. dodecanoato di metile 1. n-decano 2. n-undecano 3. n-dodecano 9. 2,6-dimetilanilina 10. dicicloesilammina 11. acido 2-etilesanoico 12. 2,6-dimetilfenolo 7. 1-ottanolo 8. 2,3-butandiolo 13. nonanale

28. Prima dell’analisi GC la soluzione deve essere diluita e il gascromatogramma deve essere ottenuto con una programmazione della temperatura che dipende dalla lunghezza della colonna e dal gas di trasporto impiegato, condizioni alle quali il metano deve possedere i tR riportati nella tabella: La composizione della miscela è tale per cui gli apici dei primi 6 composti devono collocarsi su un’unica curva. Giorgio Bonaga

29. 1 2 SN SN 7 3 13 9 4 5 12 6 10 11 8  40°C 120°C (1,65°C/min) • TEST DI GROB (colonna di 15 metri, carrier gas: elio, tR metano = 53”) • picco 8 = 30% • picco 7 = 86% • picco 13 = 97% • picco 12 = 77% • picco 9 = 88% • picco 10 = 97% Giorgio Bonaga

30. PROCEDURA TEST DI GROB • raffreddare la colonna al di sotto di 40°C; • regolare la velocità di flusso del carrier gas in modo da ottenere i tR del metano riportati nella tabella; • impostare il gradiente di temperatura in base ai dati della tabella; • portare la colonna alla temperatura iniziale di 40°C; • iniettare la soluzione in modo che vengano introdotti circa 2,0 ng di ciascun componente; • far partire immediatamente dopo il programma della temperatura in base ai gradienti riportati in tabella; • dopo aver ottenuto il gascromatogramma, tracciare la curva che collega gli apici dei primi 6 componenti; • calcolare l’altezza dei picchi degli altri 7 componenti come percentuale della distanza tra la linea di base e la curva tracciata precedentemente; • determinare il SN per le coppie di picchi 4/5 e 5/6 i calcolare il valore medio; • calcolare per interpolazione la temperatura corrispondente all’uscita del picco 6 (dodecanoato di metile), che deve essere compresa tra 110 e 140°C. In base a un nomogramma (*) disponibile nel kit del test di Grob. Questo dato consente di calcolare lo spessore di film liquido (film thickness). • ___________________________________________________________________ • (*) rappresentazione grafica di una funzione a più variabili. Giorgio Bonaga

31. PREPARAZIONE DELLE COLONNE • COLONNE IMPACCATE • Il supporto solido inerte viene sospeso in un eccesso di soluzione di fase liquida (ogni liquido di partizione ha il suo solvente idoneo in funzione della sua polarità: acetone, cloroformio, diclorometano, metanolo, acqua). Dopo decantazione il residuo (fase stazionaria con un “loading” di fase liquida compresa tra 0,5-30%) viene desolventato in stufa. • Il tubo vuoto di vetro spiralizzato (spire da 15-20 cm), in aspirazione, viene lavato con acido nitrico (10%), acqua e acetone, poi riscaldato per eliminare le tracce di solventi. All’estremità distale viene chiuso con lana di vetro e collegato ad una bevuta (trappola) collegata alla pompa da vuoto. In aspirazione si versa la fase stazionaria nel tubo di vetro, favorendo l’impaccamento tramite vibrazione meccanica del tubo (l’intensità della vibrazione dipende dalla granulometria della fase stazionaria e dal grado di impaccamento che si vuole ottenere). Si chiude anche l’estremità prossimale della colonna, già impaccata, con lana di vetro. Prima dell’uso si opera il condizionamento della colonna, ovvero si eliminano le tracce di solvente facendo fluire gas inerte alla temperatura massima del liquido di partizione per 24-48 ore. Giorgio Bonaga

32. vibratore vuoto Giorgio Bonaga

33. COLONNE CAPILLARI WCOT • Il tubo vuoto di silice spiralizzato (spire da 10-15 cm) viene pulito/attivato (“leaching”) con HCl, per eliminare dalla superficie interna le impurezze della silice (sodio e metalli di transizione) e per trasformare i gruppi silossanici in gruppi silanolici, che successivamente verranno silanizzati. Il trattamento di leaching rende rugosa la parte superficiale della parete interna della silice e la superficie così preparata viene ricoperta (“coated”) dal liquido di partizione, in due diverse modalità: • RICOPRIMENTO DINAMICO Il tubo, sotto vuoto, viene riempito per circa ¼ della sua lunghezza con una soluzione (10% in peso) del liquido di partizione sciolto in solvente basso-bollente. La soluzione, sotto la spinta di un gas inerte, si deposita sulla superficie interna del tubo come un velo e, in seguito all’evaporazione del solvente ad opera del gas, rimane soltanto un film di liquido di partizione. Se il velo di soluzione rischia di essere eccessivo, si può immettere nel tubo una piccola quantità di mercurio dopo l’introduzione della soluzione e prima dell’immissione del gas inerte. Il mercurio ha una tensione superficiale così elevata che riduce lo spessore del velo di soluzione e pertanto anche lo spessore di liquido di partizione (“film thickness”, espresso in mm) Giorgio Bonaga

34. RICOPRIMENTO STATICO Il tubo viene riempito con una soluzione (0,3-1,0% in peso) del liquido di partizione sciolto in solvente basso-bollente. Operando sotto vuoto si ha una lenta evaporazione del solvente e l’interfaccia gas/soluzione migra lungo il tubo, con deposizione del film di liquido di partizione sulla superficie interna del tubo. Lo spessore del film liquido, ovviamente, dipende dalla concentrazione della soluzione utilizzata. Giorgio Bonaga

35. COLONNE CAPILLARI SCOT • Sulla parete interna del tubo vuoto di silice spiralizzato (spire di 10-15 cm) viene creato uno strato poroso immettendo uno soluzione di idrossido di bario, seguita da un flusso di anidride carbonica. Avviene la reazione: • Ba(OH)2 + CO2 BaCO3 + H2O • il carbonato di bario si deposita sottoforma di microcristalli sui quali si depositerà il film di liquido di partizione della soluzione immessa successivamente. Con le SCOT si raggiungono due obiettivi: • maggiore superficie attiva alla ripartizione, a parità di film thickness (più elevato fattore di capacità k’, quindi migliore risoluzione); • più rapido (pseudo)equilibrio di partizione (riduzione dei tR, quindi minor allargamento dei picchi e, in conclusione, migliore risoluzione). Giorgio Bonaga

36. COLONNE CAPILLARI PLOT • Sulla parete interna del tubo vuoto di silice spiralizzato (spire di 10-15 cm) viene creato uno strato poroso immettendo uno soluzione di acido fluoridrico. Avviene la reazione: • 4 HF + SiO2 SiF4 + 2 H2O • che corrode la silice per effetto della formazione di tetrafluoruro di silicio (volatile). La superficie interna possiede ora una porosità sulla quale la soluzione di liquido di partizione, immessa successivamente, deposita il film thickness. Giorgio Bonaga

37. X X X • COLONNE CAPILLARI A FASE LEGATA • E A LEGAMI RETICOLARI • Per dare maggiore stabilità termica al liquido di partizione, ovvero per evitare il fenomeno dello spurgo (“bleed”) di liquido durante le eluizioni (che riduce la durata della colonna e peggiora il rapporto signal/noise), si può “ancorare” la fase liquida in 2 modi (sovente con entrambi). • FASE LEGATA (bonded phase) • Si impiegano delle sostanze (spesso coperte da segreto industriale) che sono in grado di formare dei legami chimici tra la superficie della silice e uno strato monomolecolare di liquido di partizione strato monomolecolare di liquido di partizione silice Giorgio Bonaga

38. R-O raggi g O-R • 2. LEGAMI RETICOLATI (cross-linked phase) • La reticolazione viene fatta per step: • nel liquido di partizione si incorporano dei perossidi (R-O-O-R); • si procede al rivestimento della superficie interna della silice con il liquido di partizione modificato chimicamente; • si espone la colonna a radiazioni g per decomporre i perossidi, i cui corrispondenti radicali liberi estraggono atomi di idrogeno ai gruppi metilici del liquido di partizione con formazione di legami C-C reticolati. R-O-O-R R-O-H H H-O-R H CH2 CH2 Giorgio Bonaga

39. Gruppo Gruppo “R” “CO” H C alfa C alfa Gruppo Gruppo H Gruppo H “N” H Gruppo “CO” “N” “R” COLONNE CAPILLARI CHIRALI Per separare degli isomeri ottici (enantiomeri = immagini speculari non sovrapponibili) si fa reagire la miscela racemica con un reagente otticamente attivo, in modo da produrre una coppia di diasteroisomeri separabili con una colonna non chirale. specchio R + + R R-R + R-S S R(ectus) S(sinister) coppia di enantiomeri (proprietà chimico-fisiche identiche) coppia di diasteroisomeri (proprietà chimico-fisiche diverse) Giorgio Bonaga

40. Da alcuni anni, però, sono a disposizione delle colonne preparate con liquidi di partizione chirali (a base di amminoacidi, b-destrina, ecc.). La separazione dei due enantiomeri è dovuta al fatto che le interazioni soluto/liquido di partizione si realizzano soltanto per l’enantiomero del soluto otticamente omologo con quello della fase stazionaria. L’impiego delle colonne chirali è, negli ultimi anni, in rapida diffusione. S * S * S R b-destrina Giorgio Bonaga

41. d 3. FASE MOBILE Nella GC è un gas inerte che svolge la funzione di trascinamento dei soluti, senza partecipare al processo di partizione, sebbene attraverso la diffusione longitudinale (B/v) il gas influisca sulla risoluzione (fattore di efficienza). Per minimizzare la diffusione longitudinale, la fase mobile dovrebbe possedere una densità (o una viscosità) elevata. Ricordando che la densità d è il peso (in grammi) dell’unità di volume di gas(in cm3) e che il volume molare (volume occupato da una mole) di qualsiasi gas è sempre uguale a 22,414 (litri): d = [h = ] 22,414 La densità dei 4 gas inerti (i pesi molari sono approssimati) utilizzati in GC sono: H2 = 2/22,414 = 0,089 . 10-3 g/cm3 He =4/22,414 = 0,178 “ “ N2 = 28/22,414 = 1,250 “ “ Ar = 40/22,414 = 1,780 “ “ F . l peso mole A .v Giorgio Bonaga

42. La scelta della fase mobile è però da mettere in relazione a 5 fattori: • densitàper ridurre la diffusione longitudinale l’ordine di idoneità dei gas inerti è inversa rispetto la densità (viscosità) dei gas: Ar > N2 > He > H2 • 2. fattore di efficienza (HETP) • a valori molto bassi della velocità lineare media di flusso (v), l’ordine di idoneità può essere desunto dai diagrammi di Van Deemter per ciascun gas inerte: N2 > He > H2, ma in considerazione del fatto che per valori v leggermente superiori (scelti abitualmente per ridurre i tR) la situazione si inverte, l’ordine reale è: H2 > He > N2 Van Deemter Plot 10 azoto HETP (mm) 5 elio idrogeno 0 0 20 40 60 v (cm/s) Giorgio Bonaga

43. 3. pressione in colonna con colonne lunghe e a temperature di esercizio basse, la pressione in colonna si ottiene con una facilità inversamente proporzionale alla densità del gas inerte e pertanto l’ordine di idoneità è: H2 > He > N2 > Ar 4. tipo di detector è forse il fattore più importante, perché la sensibilità del rivelatore è condizionata dal tipo di gas di trasporto impiegato. Ad esempio, confrontando i valori di conducibilità termica (la quantità di calore trasferita nell’unità di tempo in un tratto unitario, a causa di un gradiente di temperatura) dei gas inerti: conducibilità termica (l) (W/cm°K) W (watt) = joules/sec °K = gradi Kelvin = °C H2 = 18,1 . 10-4 He = 15,2. 10-4 N2 = 2,6 . 10-4 Ar = 1,8 . 10-4 È evidente che per un TCD (Thermal Conductively Detector) il gas più idoneo è quello che ha una l molto diversa da quella dei soluti (per i soluti organici l  2,0 .10-4). In questo caso l’ordine di idoneità è: H2 > He > N2 > Ar Giorgio Bonaga

44. 5. reattività e sicurezza il gas di trasporto non deve reagire con i soluti e non deve essere pericoloso; in accordo con questi criteri l’ordine di priorità dei gas tradizionalmente impiegati in GC è : He > N2 > H2 (infiammabile, esplosivo). NOTA Le conclusioni non convergenti a favore di un gas o di un altro, che sono emerse nella illustrazione di questi 5 fattori, fotografano la situazione reale legata alla scelta del gas di trasporto. La risposta più ragionevole è: “ … dipende”. La scelta del carrier gas dipende dalla colonna (lunghezza, diametro interno, rapporto b, ecc.), ma anche dalla temperatura, dall’iniettore e dal rivelatore scelti in base alla natura dei soluti che costituiscono la miscela da analizzare. Nonostante queste considerazioni si può concludere che, statisticamente, il gas di trasporto più utilizzato nella gascromatografia con colonne capillari è l’elio. Giorgio Bonaga

45. 4. TEMPERATURA (T) In generale, tanto minore è la temperatura tanto più il soluto tende a ripartirsi nella fase liquida, per effetto della diminuzione della sua tensione di vapore. E viceversa. Ricordando che k’ = Kd . F La costante termodinamica di ripartizione Kd, che condiziona sia il tR che il k’, dipende dal diametro della colonna e dal volume di fase liquida che impregna il supporto inerte (colonne impaccate) o che riveste la parete interna del tubo (colonne capillari), cioè dal rapporto di fase F. Ma la Kd (come tutte le costanti di equilibrio) dipende anche da una variabile di stato: la temperatura. L’equazione è: log Kd = a + b Tc dove: a, b = costanti Tc = temperatura della colonna Il diagramma dell’equazione (in cui sono trascurati le costanti a e b) mostra la diminuzione esponenziale di Kd (e quindi di k’ e di tR) all’aumentare della temperatura. Giorgio Bonaga

46. Kd (k’, tR) Tc Giorgio Bonaga

47. Per comprendere l’effetto che la temperatura esercita sui parametri gascromatografici occorre ricordare quali sono i tipi di legami intramolecolari, confrontati con quelli interatomici di natura covalente e di natura ionica. Giorgio Bonaga

48. + - Dunque, in termini molecolari bisogna spiegare quale influenza esercita la temperatura sulle interazioni soluti/fase liquida. Le interazioni tra le molecole neutre sono le forze di van der Waals (forze di London, Debye, Keesom, legami a idrogeno), quelle tra ione e specie neutra sono ione/dipolo permanenteeione/dipolo indotto, quelle tra ioni sono i legami ionici. 1. interazioni dipolo istantaneo/dipolo indotto (forze di dispersione di London): dovute all’induzione tra molecole non polari. Indipendenti dalla T + - + - 2. interazioni dipolo permanente/dipolo indotto (forze di Debye): dovute all’induzione di una molecola polare verso una molecola non polare. Decrescenti all’aumentare della T + - Giorgio Bonaga

49. + - + - 3. interazioni dipolo permanente/dipolo permanente (forze di Keesom): dovute all’induzione (orientamento) tra due molecole polari. Decrescenti all’aumentare della T (si azzerano a temperature molto alte) 4. legami a H e legami donatore/accettore (legame a H, complessi ioni metallici/sistemi insaturi): dovuti a dipoli costituiti da un H legato con legame covalente molto polare e da un elemento molto elettronegativo (N,O,F) o da sistemi p e centri parzialmente positivi o cationici. Decrescenti all’aumentare della T Na+ p d+ .. d+ d- d- HC CH O H O H Giorgio Bonaga

50. - + 5. interazioni ione/ione: dovute alla forza di attrazione coulombiana. Decrescenti all’aumentare della T (per effetto dell’agitazione termica) Nella GC, ovviamente, le interazioni appena descritte non si realizzano tra molecole entrambe dotate di cammino libero, ma tra molecole del liquido di partizione, ancorate al supporto solido inerte (impaccate) o alle pareti della colonna (capillari) e le molecole dei soluti “spinte” dal gas di trasporto. Ad eccezione dei legami ionici e dei legami accettore/donatore, le altre forze sono deboli e hanno importanza a temperature molto basse (in senso gascromatografico), ossia quando le molecole sono molto vicine. In conclusione l’aumento della T determina sempre una diminuzione di tutte le interazioni soluti/fase liquida, con conseguente diminuzione dei fattori di capacità k’ e dei tR. Giorgio Bonaga