U niversidad Nacional de Colombia

1. Universidad Nacional de Colombia Interpretación de patrones de Restricción del DNA producidos por PFGE: Criterios para la tipificación de Cepas Bacterianas. Facultad de Medicina Departamento de Patología

2. HERBERT PUENTES PUENTES Residente I Patología Universidad Nacional de Colombia

3. GENERALIDADES - PFEG • Esta técnica separa moléculas de DNA en matrices de agarosa, sometiéndolas en campos eléctricos que se alternan en dos direcciones. • Se considera el “Gold standard” de los métodos de tipificación molecular de cepas bacterianas. • Permite separar moléculas desde 20 Kpbs hasta 10 Mpbs.

4. GENERALIDADES - PFEG • Los aislamientos bacterianos crecen en un medio de cultivo habitual, y luego se combinan en agarosa fundida colocándose en pequeños moldes. • Obteniéndose insertos de agarosa “plugs” que contienen las bacterias completas.

5. GENERALIDADES - PFEG • Estas se someten a lisis “in situ” obteniendose DNA libre que permanece inmovilizado en la matriz de agarosa. • Este DNA se corta con una enzima de restricción que tenga una frecuencia baja de corte según el genoma estudiado.

6. HISTORIA - PFEG • Bruno Zimm et al. 70’s demostraron que: .“Después de remover un campo eléctrico, la molécula elongada de DNA se relajaba nuevamente a su estado no perturbado, y que la velocidad de relajación dependía de la longitud del DNA”

7. HISTORIA - PFEG • David Schwartz, teorizó que: Esta propiedad de relajación del DNA podría ser usada para separar moléculas grandes de DNA, ya que al cambiar periódicamente la orientación del campo eléctrico, se podría forzar a estas moléculas a relajarse en el gel durante la remoción del 1º campo y a elongarse para alinearse con el nuevo campo.

8. HISTORIA - PFGE • David Schwartz, demostró la efectividad de su método de alternancia de campo, al separar cromosomas de levadura de cientos de pares de bases de longitud.

9. FUNDAMENTO - PFGE • Cuando el primer campo eléctrico se aplica al gel las moléculas se alargan en dirección al campo y migran en elgel.

10. FUNDAMENTO - PFGE • Luego el primer campo eléctrico se suprime y un segundo campo formando algún ángulo con el primero, se activa. • Entonces el DNA debe cambiar su conformación y reorientarse antes de que pueda migrar en la dirección del 2º campo eléctrico.

11. FUNDAMENTO - PFGE • El tiempo requerido para esta reorientación tiene mucho que ver con el tamaño de la molécula. • Moléculas más grandes tardan más tiempo en realinearse. • El tiempo en que tarda activo cada campo se denomina pulso y su duración depende del tamaño de las moléculas que se quieran separar.

12. EQUIPO PARA PFGE

13. TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE • Dependiendo de la geometría del electrodo, la homogeneidad y el método de reorientación de los campos eléctricos existen varios sistemas de PFGE.

14. TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE • Los diferentes sistemas descansan sobre el mismo principio, someter a las moléculas de DNA a por lo menos dos campos eléctricos que se alternan. • El tamaño limite máximo que puede ser resuelto por estos sistemas parece ser el mismo.

15. SISTEMAS DE PFGE

16. TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE • Las principales diferencias entre los sistemas son: - Capacidad de obtener líneas rectas. - La velocidad de separación. - La resolución dentro de un rango particular de tamaños. - El tamaño de la porción del gel que provee separación útil.

17. TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE • Aunque muchos tipos de instrumentación para PFEG están disponibles en la actualidad, estos generalmente caen en dos categorías básicas. • La primera incluye el método más sencillo el FIGE (Field Inversion Gel Electrophoresis)

18. SISTEMA FIGE • Es el equipo más simple diseñado para electroforesis en campo de inversión. • Funciona mediante la inversión periódica de la polaridad de los electrodos. • Somete el DNA a una reorientación de 180º.

19. SISTEMA FIGE • Por lo que este gasta una cantidad de tiempo mayor en moverse hacia atrás. • Un módulo de control del campo eléctrico, una caja de gel standard vertical u horizontal con control de temperatura.

20. TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE • Los instrumentos de la siguiente categoría poseen la capacidad de reorientar el DNAen un pequeño ángulo oblicuo, generalmente entre 96 y 120º. • Esto hace que el DNA siempre se mueva hacia adelante en un patrón en “zig-zag”, dentro del gel.

21. TIPOS DE SISTEMAS DE PFGE • Bajo un rango de tamaño y condiciones óptimas similares, estos equipos son más rápidos. • Generan un amplio rango de tamaños en los fragmentos y proporcionan una porción útil más grande del gel comparados con FIGE

22. SISTEMA TAFE (TRANSVERSE ALTERNANTING FIELD ELECTROPHORESIS) • Usa una complicada geometría entre sus electrodos y un gel localizado verticalmente, para obtener líneas rectas.

23. SISTEMA RGE (ROTATING GEL ELECTROPHORESIS) • Mantiene un campo eléctrico homogéneo, en combinación con un gel horizontal. • El campo eléctrico es fijo, para mover el DNA en una nueva dirección , el gel simplemente rota.

24. SISTEMA CHEF (CLAMPED HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD ELECTROPHORESIS) • Sistema que se caracteriza por obtener líneas rectas empleando para tal fin campos homogéneos. • 24 electrodos se disponen en arreglo hexagonal.

25. SISTEMA CHEF (CLAMPED HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD ELECTROPHORESIS) • El voltaje de la fuente de poder se divide en esos electrodos de tal forma que el gradiente de voltaje que se produce es constante a lo largo de todo el gel. • El ángulo de orientación de los campos puede variar entre 60 y 120º.

26. APLICACIÓN DE LOS CAMPOS ELECTRICOS EN UN SISTEMA CHEF • Cambia la dirección del campo eléctrico electrónicamente para reorientar el DNA, mediante cambio de la polaridad en el arreglo de electrodos.

27. BIO-RAD - CHEF DR III SYSTEM

28. BIO-RAD CHEF-DR III PULSED FIELD ELECTROPHORESIS SYSTEM • “Permite que grandes móleculas de DNA(del tamaño de cromosomas o millones de pares de bases), sean eficientemente separadas” . • “El DNA obtenido de tal manera puede usarse para el análisis cariotipico.”

29. BIO-RAD CHEF-DR III PULSED FIELD ELECTROPHORESIS SYSTEM • “Los cromosomas pueden evaluarse para mapear las localizaciones de genes de interés, y el DNA digerido con endonucleasas de restricción puede evaluarse también para detectar polimorfismos de longitud.” • “La cámara de 14 cm x 12.7 cm que contiene el gel de agarosa puede cargarse con más de 15 muestras (moldes de 6 mm x 1.5 mm ) y el módulo de enfriamiento se usa para mantener una temperatura constante al nivel operacional de 14° C.”

30. TÉCNICA

31. OBTENCION DE LAS CEPAS BACTERIANAS • Las bacterias de la muestra a aislar se ponen en crecimiento en el medio de cultivo apropiado, en condiciones microaerófilas (10% CO2, 5% H2 y 85% N2), toda la noche a 42ºC. • Todos los aislados deben ser previamente identificados al nivel de especie por las técnicas standard. • Las suspensiones celulares se obtienen de la superficie de las cajas de cultivo, mediante un escobillón.

32. PREPARACION DE LOS INSERTOS “PLUGS” DE AGAROSA • Las suspensiones se hacen en tubo seco con 2 ml de buffer salino fosfatado (PBS: 0,01 fosphate buffer, [pH 7,4] o con buffer de suspensión celular (CBS 100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8). • Cada suspensión celular fue ajustada a una densidad óptica de 0,35 a 0,45 usando un turbidímetro.

33. PREPARACION DE LOS INSERTOS “PLUGS” DE AGAROSA • Esto corresponde a valores de absorbancia de 0,570 a 0,820 a una longitud de onda de 610 nm usando un espectrofotómetro. • Una alícuota de 400 microl de la suspensión se transfieren a tubos de 1,5 ml de una microcentrífuga con 25 microl de proteinasa K, y mezclados por agitación suave 3 o 4 veces.

34. PREPARACION DE LOS INSERTOS “PLUGS” DE AGAROSA • Otros 400 microl de agarosa fundida al 1% en TE (100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) son adicionados a la suspensión celular, y mezclados suavemente con una pipeta hacia arriba y abajo por 3 veces. • La suspensión así obtenida fue vertida de inmediato en unos moldes reutilizables para obtener los “plugs”.

35. PREPARACION DE LOS INSERTOS “PLUGS” DE AGAROSA • Posteriormente los “plugs”, se dejan a solidificar a temperatura ambiente por 15 minutos, o en nevera a 4ºC por 5 minutos.

36. LISIS CELULAR EN LOS “PLUGS” • Los “plugs” se llevan a tubos de 50 ml, que contienen buffer de lisis (50mM Tris, 50mM EDTA, [pH 8], 1% de sarcocina, 0,1 de proteinasa K/ml). • La lisis se deja llevar a cabo por 15 min. en un agitador orbital de agua, con constante y vigorosa agitación. • Aquí los tiempos de lisis varían según la cepa bacteriana y varían entre 0,25, 0,5, 1, y 2 horas.

37. LAVADO • Después de la lisis los “plugs”, se lavan 3 o 4 veces, 15 a 20 min. por lavado a 54ºC. • Una vez con agua estéril ultrapura y tres veces con buffer TE [pH 8]. • Tanto el agua como el buffer se precalientan a 54ºC. • Luego de el último lavado, se adicionan 5 ml de buffer TE fresco a Tº ambiente.

38. DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCION • Una amplia lámina de 2mm se corta de cada “plug” con un bisturí o con una cuchilla de afeitar. • Y se transfiere a un tubo que contiene 1 X de buffer de restricción con la cantidad especificada de la enzima de restricción. • La elección de esta varía en la literatura internacional dependiendo de la cepa ?, al igual que el tiempo de incubación.

39. ENZIMAS DE RESTRICCION

40. DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCION • Las láminas se incuban a temperatura ambiente (23 a 25ºC por 2 horas). • Antes de moldear el gel, la mezcla de restricción es reemplazada por 200 microl de buffer TBE (10 X TBE = 0,89 M de Tris borado, 0,02 EDTA, pH 8,3) • Las láminas se llevan a Tº ambiente por 5 min, y luego se llevan al recipiente apropiado para electroforesis con gel de agarosa SKG al 1%.

41. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) • El gel se prepara en agarosa SKG al 1% en TE 0,5 X (Tris 0,1 M, Ácido bórico 0,08 M, EDTA 0,1 mM). • Existen diversos protocolos en lo referente a la duración e intensidad de los pulsos eléctricos.

42. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) • En el protocolo de PFEG del CDC para tipificación del C. Jejuni, usaron un tiempo inicial de “switch” de 6,75 seg. con un “switch” final de 38,35 sg. • En un gradiente de 6V x cm. y un ángulo incluido de 120º.

43. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) • Estos valores de tiempo “switch” pueden calcularse usando la función de auto-algoritmo del CHEF mapper (Bio-Rad), para separar fragmentos en el rango de 50 a 400 kpb. • En este equipo el tiempo total estimado de electroforesis es de 18 horas.

44. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) • Después de completada la electroforesis, los geles se tiñen con 400 ml de solución de Bromuro de Etidio (50 microg/ml) • Y el patrón de bandas se observa bajo iluminación con rayos UV. • Y se fotografían con cámara polaroid.

45. ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE) • La imagen digitalizada del gel se introduce al programa “Quanty one - Discovery Series” (Bio-Rad), donde se estima el peso molecular de cada fragmento. • El programa tiene la capacidad de tener en cuenta los defectos de migración como “sonrisas” o líneas convergentes, al estimar los pesos moleculares, siendo así más preciso.

46. ANALISIS COMPUTADORIZADO PARA LOS PATRONES DE PFGE • En el protocolo del CDC los patrones fueron analizados usando el software “Molecular analyst fingerprinting package” (version 1,2 Bio-Rad). • Determinándose así el error intra o intergeles • Las imágenes se normalizan, por alineación de los picos de una cepa standard, misma que se carga en dos o tres líneas de cada gel.

47. TECNICA FINAL

49. INTRODUCCIÓN • Frecuentemente los microbiólogos clínicos se ven abocados a a determinar la relación de un grupo de aislamientos bacterianos, en el evento de un brote epidémico.

50. INTRODUCCIÓN • En la última década los métodos tradicionales de tipificación de bacterias han sido reemplazados por nuevos métodos moleculares como “fingerprinting” de plásmidos, ribotipificación, PCR y análisis de patrones de restricción del DNA cromosómico por PFEG.