The RNA molecules required for translation in E coli .

2. The RNA molecules required for translation in E coli. Sedimentation coefficient (S) Molecular weight Percentage (%) of cell RNA Number of nucleotide Ribosomal RNA (rRNA) Transfer RNA (tRNA) messenger RNA(mRNA) 80 23 1.2 X 106 3700 16 0.55 X 106 1700 5 3.6 X 104 1700 15 4 2.5 X 104 75 5 Heterogenous varies mRNA와 20개의 amino acid를 섞어도 단백질은 합성되지 않는다. 다른 cellular component들이 요구된다. 이들 component들을 각기 분리하여 test tube안에서 하나의 과정을 증명하는 방법을 reconstitutiontest라 한다. sucrose gradient centrifugation에 의해 필요한 component를 분리하였다.

3. The sucrose-gradient technique. • 농도가 다른 sucrose 용액을 이용하여 density gradient를 만든다. • Sample을 상층부에 놓는다. • 원심분리를 통해 다양한 물질들의 크기와 모양 속도에 따라 침전속도의 차이를 보여 분리된다. 이들이 가라앉는 속도를 sedimentation coefficient (s)로 표기한다. • 다른 fractions들이 band를 형성. • 다른 band들을 밑에 구멍을 내어서 따로 모은다.

4. Overlapping과 nonoverlapping code의 차이점. • Overlapping code; 위의 그림에서와 같이 다른 codon에서 이용된 base가 다른 codon에서도 반복적으로 이용되는 경우. • Nonoverlapping code; 한번 사용된 codon이 다음 codon에서 사용되지 않는 경우. By 1961, it was already clear that the genetic code was nonoverlapping. The analysis of mutationally altered proteins, in particular, the nitrous acid generated mutants of tobacco mosaic virus, showed that only a single amino acid changes at one time in one region of the protein. This result is predicted by a nonoverlapping code. As you can see from the abovefigure, an overlapping code predicts that a single base change will alter as many as three amino acids at adjacent positions in the protein.

5. Number of letters. 모든 생물은 4개의 letter(A, C, G 그리고 T)로 구성된 word(codon)으로 20개의 amino acid를 표현해 낸다. 따라서 4개의 letter로 20개 이상의 어휘 (Vocabulary)를 조합 하여야 한다. 1 (single) 2 (doublet) 3 (triplet) 가능성 4 4 X 4 4 X 4 X4 어 휘 4 16 64 적어도 3개의 nucleotide가 하나의 codon을 의미하여야 단백질을 이루는 20개의 amino acid를 모두 표현 할 수 있다.

6. Use of suppressor to demonstrate a triplet code. Experiments by Francis Crick and Sidney Brenner • Proflavin에 의하여 생긴 T4 phage의 rII 돌연변이(FCO라고 부름) 를 이용. (* Proflavin은 DNA에 nucleotide를 추가 (additionj) 혹은 제거 (deletion)을 유도하는 mutagen이다.). • FCO 돌연변이를 proflavin으로 2차 돌연변이를 유도하여 정상개체를 유도하였다. 이렇듯 2차 돌연변이에 의해 본래의 돌연변이 기질이 원래로 돌아오는 현상을 suppression이라하고 그러한 돌연변이를 suppressor이라한다. • Recombination을 통해 suppression을 일으킨 돌연변이는 동일한 rII에 일어난 것임을 확인

7. 2차 돌연변이에 의한 suppression에 대한 해석. 첫 돌연변이는 proflavin에 의해 addition이 일어 날 수 있고, proflavin에 의한 둘째 돌연변이는 다른 위치에 deletion이 발생하여 전반적으로 wild type protein과 동일하지는 않지만, 기능상 동일한 단백질이 합성된다. Wild type FCO Suppressor • 발견 • proflavin에 의한 돌연변이의 suppression이 항상, addition에 의한 것은 deletion에 의해 일어남을 반복적으로 확인하였다. • 연속적으로 3회 addition이나 deletion이 일어나면 또한 suppression이 됨을 확인하였다.

8. Degeneracy of the genetic code 정의; 하나의 amino acid가 다수의 triplet codon에 의해 규정된다는 설. 설명; Crick에 의해 연속하는 3개의 base가 하나의 amino acid를 coding한다. 따라서 64개 조합의 codon이 존재하고 20개의 amino acid만이 있으므로 하나의 amino acid가 여러 개의 codon에 의해 coding될 수 있음.

9. Translation의 주요 사항 1. The genetic code is nonoverlapping. 2. Three bases encode an amino acid. These triplets are termed codons. 3. The code is read from a fixed starting point and continues to the end of thecoding sequence. We know this because a single frameshift mutation anywhere in the coding sequence alters the codon alignment for the rest of the sequence. 4. The code is degenerate in that some amino acids are specified by more than one codon.

10. 유전 암호의 해독 Breakthrough; test tube에서 특정 효소 (polynucleotide phosphorylase)로 RNA를 nucleotide를 재료로 합성 기술 개발. 실험 1; poly (U)로 부터 phenylalanine로만 구성된 단백질이 합성됨을 확인. 실험 2; 특정 nucleotide 비율로 RNA 합성한 후, 합성되는 단백질의 amino acid 성분 조사. 예로서 uracil:guanine을 3:1로 섞어서 RNA 합성 후, 나오는 단백질의 amino acid 성분 조사.

11. Expected Frequencies of Various Codons in Synthetic mRNA Composed of 3/4 Uracil and 1/4 Guanine Ratio* codon probability UUU p(UUU) =3/4 × 3/4 × 3/4 =27/64 1.00 UUG p(UUG) =3/4 × 3/4 × 1/4 =9/64 0.33 UGU p(UGU) =3/4 × 1/4 × 3/4 =9/64 0.33 GUU p(GUU) =1/4 × 3/4 × 3/4 =9/64 0.33 UGG p(UGG) =3/4 × 1/4 × 1/4 =3/64 0.11 GGU p(GGU) =1/4 × 1/4 × 3/4 =3/64 0.11 GUG p(GUG) =1/4 × 3/4 × 1/4 =3/64 0.11 GGG p(GGG) =1/4 × 1/4 × 1/4 =1/64 0.03 * Ratio는 UUU codon이 나올 확룔을 1로 하였을때, 다른 것이 나오는 비

12. Phenylalanine 1.00 Leucine 0.37 Valine 0.36 Cysteine 0.35 Tryptophan 0.14 Glycine 0.12 Observed Frequencies of Various Amino Acids in Protein Translated from mRNA Composed of 3/4 Uracil and 1/4 Guanine Amino acid ratio

13. 위의 실험 결과로 얻은 유추. 하나의 guanine과 두개의 uracil로 이루어진 codon (G+2U)은 valine, leucine그리고 cysteine을 code할 수 있다. 또한, 하나의 uracil과 2개의 guanine으로 된 codon(U+2G)은 tryptophan과 glycine을 code한다. 이러한 방법으로 예비적인 codon은 Nirenberg와 Severo Ochoa에 의해 밝혀졌다.

14. tRNA가 codon을 인지한다. Cysteine을 가지는 tRNA를 nickel hybride를 처리하면 cysteine이 alanine으로 변한다. 이렇게 변형된 tRNA를 이용해서 단백질을 합성하면, cysteine이 와야할 자리에 항상 alanine이 위치함을 확인 할 수 있다. tRNA는 염색체에 coding되어 있으며, 임의로 특정 3차구조를 형성한다. 이들 3차 구조와 특수 염기의 차이에 의해 다른 tRNA들이 다르게 인식 될 수 있다. tRNA의 anticodon부분이 mRNA와 상보적으로 결합하여 유전 정보를 해석한다.

15. tRNA의 2차 구조. • The functional areas of a generalized tRNA molecule. • (b) The specific sequence of yeast alanine tRNA. Arrows indicate several kinds of rare modified bases.

16. Yeast phenylalanine tRNA의 3차 구조. 변형된 nucleotide는 y, mG, m2G, mI, 와 DHU (or UH2)로 각기 표기하며 pseudouridine, methylguanosine, dimethylguanosine, methylinosine, 그리고 dihydrouridine들을 각기 나타낸다.

17. 유전 암호의 왼전 해독. 실험1; mini mRNA (3개의 nucleotide로 구성된 mRNA)를 합성한다. 이들 mini mRNA를 이용하여 어느 종류의 aminoacyl-tRNA가 ribosome과 결합하는 알아본다. 실험2; repeating copolymers를 이용하여 어떤 종류의 단백질이 합성되나 확인. 예로서 AGA가 다수 반복되는 AGAAGAAGAAGAAGAAGA…를 template로 사용하여 합성되는 단백질의 성분 조사.

18. The Genetic Code.

19. Multiple codons for a single amino acid. 하나의 amino acid를 다수의 codon에 의해 coding된다. 예로서 tryptophan은 하나의 codon(UGG)만을 가지나, serine은 6개의 codon (UCU or UCC or UCA or UCG or AGU or AGC)을 소유. • 방법 • 여러 종류의 tRNA가 하나의 amino acid를 운반하는 경우. • 하나의 tRNA가 여러 개의 codon과 결합하는 경우.

20. UCU UCC tRNASer1 AGG + wobble UCA UCG tRNASer2 AGU + wobble AGU AGC tRNASer3 UCG + wobble Different tRNAs That Can Service Codons for Serine Codon tRNA anticodon

21. Wobble posotion에 있는 nucleotide는 하나의 nucleotide와 결합할 수 있다. 3번째에 위치하는 nucleotide는 직선상에서 빗나가 있으므로 위의 그림과 같이 비겨서 하나 이상의 nucleotide와 결합할 수 있다. 이러한 현상을 wobble이라 한다.

22. G U or C C G only A U only U A or G I U, C, or A Codon-Anticodon Pairings Allowed by the Wobble Rules 5’ end of anticodon 3’ end of codon I (inosine) is one of the rare bases found in tRNA, often in the anticodon.

23. Brenner's work with the T4 phage in 1965. • Brenner는 T4 phage의 head protein에 이상이 있는 일련의 돌연변이를 발견 하였고, 이들의 공통점을 찾았다. • Wild type protein보다 작은 head protein을 합성. • 특정 돌연변이를 가지는 host strain (suppressor)에서 wild type을 보임. 실험과 해석; 돌연변이 단백질을 분석하여 glutamine, lysine, glutamic acid, tyrosine, tryptophan 그리고 serine에서 stop됨을 알아내었다. 또한 이들이 하나의 base 변화에 의해 UAG로 전환됨을 착안하여 stop codon을 처음으로 해석. stop codon의 종류; UAG (amber), UGA (opal) 그리고 UAA (ochre)라 한다.

24. Protein synthesis. 단백질 합성은 일련의 화학 반응으로 이루어져있다. 1. ATP라는 energy를 이용하여 amino acid를 tRNA에 결합시킨다. 2. Ribosome에 있는 peptidyl transferase에 의해 tRNA에 각기 있던 amino acid가 peptide 결합에 의해 연결된다. 3. 마지막 amino acid가 결합될 때까지 계속 새로운 amino acid가 합성된다. 4. 성공적인 단백질 합성을 위해서, mRNA, tRNA, ribosome 그리고 추가로 다른 enzyme들이 필요하다.

25. 단백질을 합성하는 Ribosome. Ribosome은 크고 작은 2개의 subunit으로 구성된다. 각 subunit은 자신의 rRNA와 다수의 단백질로 구성된다. prokaryote의 ribosome (a)는 eukaryote ribosome에 비하여 작다. 이들 각기 component는 sedimentation coefficient (S)를 단위로 하여 표시한다.

26. Ribosome에서 단백질의 합성. RNA는 30S subunit에 결합하고 tRNA는 두 subunit에 걸쳐 결합한다. Aminoacyl-tRNA는 A site에 결합하며, 성장하는 polypeptide를 가지는 tRNA는 P site에 결합한다. 단백질 합성은 시작 (initiation), 성장 (elongation) 그리고 멈춤 (termination)으로 구분된다.

27. Initiatior, N-formylmethionyl tRNA in E coli. E coli와 같은 prokaryote에서는 eukaryoye과는 달리 N-formylmethionyl tRNA에 의해 translation이 시작된다. 따라서 N-formylmethionyl tRNA 를 initiator RNA라 부른다. Initiator는 주로 AUG와 GUG를 인지하며 드물게 UUG를 인지한다.

28. Steps in the initiation of translation 단백질 합성에는 mRNA, tRNA와 ribosome 이외에 initiation factor (if1, IF2 그리고 IF3)라는 단백질들을 필요로 한다. • Initiation은 mRNA와 30S ribosome의 결합으로 시작한다. 이 반응은 IF3가 관여한다. 단백질 합성에 관여하지않는 ribosome은 두개의 subunit으로 나뉘어 있다가, 단백질 합성시에만 결합한다. • IF2가 GTP와 fMet-tRNA 결합하여 ribosome의 P site에 fMet-tRNA를 올려 놓는다. • Ribosome의 단백질에 의해 GTP가 가수분해되고 50S subunit이 결합하면서 IF2와 IF3가 떨어져 나간다.

29. Translation initiation site을 결정하는 Shine-Dalgarno sequence. E. coli와 bacteriophages의 translation initiation site의 공통적인 sequence. translation이 시작되는 위치에서 약간 위로 16S rRNA와 상보적인 sequence가 있으며 서로 결합 (hybridization) 하여 ATG initiation site을 찾는다.

30. Binding of the Shine-Dalgarno sequence on an mRNA to the 3 end of 16S rRNA.

31. Termination of protein synthesis. Termination codon은 tRNA에 의해 인지되는 것이 아니라, releasing factor라는 단백질에 의해 인지된다. RF1은 UAA와 UAG를 RF2는 UAA와 UGA를 각기 인지하며, RF3는 peptide가 ribosome에서 분리되는 것을 촉매한다.

32. Nonsense suppressor mutations. • Termination of translation. UAG가 있으면 단백질 합성은 중지된다. 이로써 단백질은 방출되고 translation은 끝나게 된다. • tyrosine tRNA에 돌연변이가 발생하여 AUG anticodon이 AUC로 바뀌면 UAG stop codon을 인지 할 수 있게 된다. • 돌연변이에 의해 생긴 nonsense mutation은 이러한 tRNA의 2차 돌연변이에 의해 suppression (억제)될 수 있다.

33. Overview of protein synthesis 30S ribosome이 mRNA의 starting point를 인지한다. Initiator tRNA와 결합하고 50S ribosome과 결합하여 translation을 수행한다. Aminoacyl tRNA들이 elongation factor들의 도움으로 A site으로 운반된다. P site의 peptidyl tRNA와 peptidyl transferase에 의해 새로운 peptide bond가 형성된다. Ribiosome이 stop codon을 만나면 releasing factor가 A site에서 단백질의 분리를 돕는다.