Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung

1. Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt AG Nimmerjahn

2. Fc Rezeptoren (FcR) • Rezeptoren für Immunglobuline • Expression auf Immunzellen • Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern  Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems

3. Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren Fc Rezeptor für IgA  Fc a R IgG  Fc g R IgE  Fc e R IgM  Fc m R IgD  Fc d R Maus  4 Gene für FcgRI FcgRII FcgRIII FcgRIV Mensch  8 Gene für FcgRI (A, B, C) FcgRII (A, B, C) FcgRIII (A, B) FcR Arten

4. a g2 a g2 Fc g Rezeptoren • Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR • verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion FcgRIV FcgRI FcgRIIB FcgRIII Mouse ITAM ITIM g2 a a a g2 low/medium affinity high affinity FcgRI FcgRIIA hFcgRIIIA FcgRIIB Human ITAM ITIM g2 a a a

5. FcgR • Aktivierende FcgR • FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII • Inhibierende FcgR • FcgRIIB • werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert • Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen • Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und inhibitorischen Signalweg • Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der Immunantwort bestimmt • Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert • Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibody-dependend cellular cytotoxity (ADCC)

6. FcgRI FcgRIIB ITAM g2 a ITIM a Signalleitung • Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung assozierte Adaptermoleküle • Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig • Am häufigsten ‚common g chain‘ • Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) • Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) • Braucht kein Adaptormolekül

7. Signalleitung aktivierender FcgR • Src-family Kinase phosphoryliert ITAM • SH2 Bindedomäne entsteht • Syk bindet • Signalkaskade wird eingeleitet • Ras/Raf/MAP Kinase pathway wird aktiviert • Kalzium abhängige Signalwege aktiviert downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK) • cellactivation • ADCC • Phagocytosis • Cytokine release • Oxidative burst

8. Co-Ligation beider FcgR führt zu Phosphorylierung des ITIM vom FcgRIIB SHIP bindet an entstandene SH-2 Dömäne Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ) Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR

9. FcgRIIB ITIM a Inhibitorischer FcgRIIB (CD32) • Größe: 40 kDa • Aufbau: • 2 extrazelluläre Domänen • 1 Transmembranregion • 1 cytoplasmatischer Schwanz • geringe Affinität für monomeres IgG • hohe Avidität für Immunkomplexe • Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) • 2 Isoformen • IIB-1 Signalwirkung • IIB-2  Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch • Einziger FcR auf B-Zellen

10. Co-Ligation mit: Sich selbst  führt zu Apoptose BCR  Verminderung des BCR Aktivierungssignal  anti-apoptotisches Signal Co-Ligation mit BCR führt zur Aktivierung der Kinase Lyn Lyn phosphoryliert ITIM des FcgRIIB Initiation des Signalwegs (SHIP) Blockiert Ras Weg und Kalzium-signalkette (Btk und PLC-g) FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen

11. FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt • FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen • Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation  mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz  mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen  FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz • Untersuchung von Toleranz: Autoimmunanfällige Mausstämme(NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr)entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)

12. FcgRIIB und Toleranz • Balb/C • Wie WT • B6 • Erhöhte Sterberate • Entzündungen in Vielzahl von Organen • Erhöhter Proteingehalt im Urin • Glomerulonephritis • Nierenversagen  genetischer Hintergrund ist sehr wichtig • Bolland und Ravetch 2000 • Fcgr2b -/- Mäuse (Balb/C und C57.B6)

13. Test auf anti-nucleäre AK • Immunfluoreszenzfärbung von Hep-2 Zellen • Inkubation mit Serum der Mäuse • Detektion von gebundenem IgG mit FITC-anti-mouse IgG • ELISA IgG AK gegen: • dsDNA • dsDNA mit Histon 1 • dsDNA mit Histon 2A und 2B  Toleranzverlust in FcgRIIB-/- Bolland und Ravetch 2000

14. Kontrollvektor Fcgr2b Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB • McGaha et al. 2007 • Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB Gewinnung von KM-Zellen aus autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen Transduktion mit retroviralem Vektor Rekonstitution bestrahlter Mäusemit autologem tranduziertem KM FcgRIIB Mock

15. Untersuchung der Mäuse Indirekter ImmunofluoreszenzassayANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen Überlebensrate NZM2410 Fcgr2b Mock ELISA • Verbessertes Überleben • Weniger Auto-AK McGaha et al.

16. Schlussfolgerung • FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz • Bei Fehlen des Rezeptors entsteht • IgG anti-DNA AK  Verlust von Toleranz • Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB Levels • Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz

17. Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung Wo genau reguliert er?

18. Keimzentrum (germinal center) • Induzierbare lymphoide Mikroumgebung • Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene • Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die Lymphorgane • AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären dendritischen Zellen (FDC) präsentiert • Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region des BCR in GC-B-Zellen • Selektion von hoch affinen B Zell Varianten • Formation von Memory B Zellen

19. Keimzentrum • Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität  muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig affinen B-Zellen unterscheiden • Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt stimuliert  Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten  Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR • Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion durch IC Interaktion • FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen eliminieren

20. Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999 • Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen

21. Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen Facs 2.4G2  FcgRIIB K9.361 FcgRIIB B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen B220+IgD-GL7+  GC B-Zellen Milzzellen Immunisiert mit NP-CGG Histologie 9 Tage nach Immun. Histologie Milz 2.4G2  FcgRIIB GL7  GC • Bestrahlte IIB -/- Mäuse • Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen •  Färbung des IIB Rezeptors im GC nur bei B-Zellen Chimäre Mäuse • FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen  reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung Rao et al. 2002

22. Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten Tieren Autoimmunanfällig (SLE) NZB (NZB x NZW)F1 Nicht-anfällig NZW geringere Expression von FcgRIIB auf GC-B-Zellen in allen Mäusen In autoimmunanfälligen Mäusen ist FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen geringer als bei nicht anfälligen Mäusen Verminderte FcgRIIB Expression in GCB-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen Jiang et al. 1999

23. Zusammenfassung Rao et al./Jiang • Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert • FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch geringer

24. Wirkmechanismus von FcgRIIB? • Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung? • Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC? • Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?

25. Modellsystem 3H9 Maus • Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen • Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt • Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus • Insertion im Igh Locus (IgMa Allel) • Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz • Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen autoreaktive AK • Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer Argininreste  DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste • 3H9/56R  ein Arg Rest • 3H9/56R/76R  zwei Arg Reste

26. Modellsystem 3H9 Maus Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK (je basischer  höhere Autoreaktivität)

27. Fukuyama et al. 2004 • Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b Expression • Balb/C und C57.B6 • Untersuchung der Toleranzerhaltung

28. Spezifität des genetischen Hintergrundes • Balb/C Hintergrund: • Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten • C57.B6 Hintergrund: • Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R ELISA Anti-DNA IgM IgG Serum C57.B6: 12 Wochen alt Fukuyama et al.

29. Mechanismus zum Erhalt der Toleranz • Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen • Vκ21D  Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der schweren Kette unterdrückt • Vκ38c  weniger effizient • Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den Mausstämmen • Unabhängig von FcgRIIB Fukuyama et al.

30. IgG IgM FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion ELISA • Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl von IgG anti-DNA • durch erhöhtes Auftreten von IgG produzierenden Plasmazellen/Plasmablasten Serum Anti-DNA Splenocyten Fukuyama et al.

31. IgG anti-DNA ist pathologisch • C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach 6 Mo. starke Glomerulonephritis • Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche Pathologie wie pos. Kontrolle (Fcgr2b -/-) • Glomerulonephritis • Immun-Komplex Ablagerung • Komplement C3 Ablagerung Histologie der Niere Nach 9 Mo. Fukuyama et al.

32. Zusammenfassung Fukuyama et al. • „Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln • Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen Mausstämmen • FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden Plasmablasten • negatives Feedback-Signal ist gestört • Proliferation autoreaktiver Plasmazellen

33. Paul et al. 2007 • Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz • Prinzip: follicular exclusion • Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von Milzfollikeln • Hypothese: folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling • Versuchsprinzip: 3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB  wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer Exclusion auftreten

34. Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/- Milz • Bei Paarung von 3H9 mit λ1 leichter Kette entsteht autoreaktiver AK • λ1 B-Zellen exprimieren transgenen IgMa Allotypen • FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte Frequenz von λ1 B-Zellen  autoreaktive AK für weitere Nachweise Paul et al.

35. Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz • Histologische Untersuchung der Milz • 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse: • λ1 B Zellen an T-B Grenze von Milzfollikeln • 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse: • λ1 B Zellen in gesamten Follikel verteilt λ1 B Zellen B-Zell Zone T-Zell Zone • Stärkere Keimzentrumsaktivität in FcgRIIB-/- Mäusen • λ1 B-Zellen im Keimzentrum 100-fach 600-fach Paul et al.

36. Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren FACS Milz • Kein Unterschied bei IgM anti-DNA produzierenden B-Zellen • 8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA produzierenden B-Zellen in3H9RIIB-/- Tieren • Klassenwechsel der autoreaktiven B-Zellen hat stattgefunden B220: B-Zell Marker CD138: Marker für Plasmazellen ELISPOT Anti-DNA Paul et al.

37. Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum Serum Anti-DNA • 3H9FcgRIIB-/- Mäuse: • Höhere Anzahl an IgG und IgM anti-DNA AK • Alle Beobachtungen waren Altersabhängig: • Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (2 Monate alt) zeigten WT verhalten • Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA Paul et al.

38. Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.) • FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen  Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen

39. Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB • FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz • Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich exprimiert (Rao et al.) • In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer exprimiert (Jiang et al.) • Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten • Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel (Paul et al.)

40. Unser Projekt • Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei der Toleranzerhaltung

41. FcgRIIB und Toleranz beim Menschen • systemischer Lupus Erythematodes (SLE) • hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern • Allele Varianten von FcgRIIB • Ile232Thr  Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen keine Assoziation in Europäern • Promoter Polymorphismus • in Europäern • Verminderte Expression in memory B-Zellen • in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung  Hohe Heterogenität im Menschen  Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig

42. Mensch vs. Maus • FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich • Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen • Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt  humanisierte Maus • Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche Immunsystem gültig?

43. GFP Reporter Gen miRNA Promoter n Versuchsaufbau Vorbereitung der hHSC: Isolation Transduktion mit lentivirus kodierter miRNA hHSC Vorbereitung der Mäuse: Bestrahlung Neugeborenen Rag2-/- NOD/SCID Rekonstitution mit hHSC Mäuse entwickeln menschliches Immunsystem

44. Untersuchung des Immunstatus • Gesundheitszustand • Überleben • Vitalität • Veränderte B-Zell Antwort • Schwellenwert • Antikörper-Affinität • Veränderter Klassenwechsel • anti-DNA AK • antinucleäre AK • anti-Chromatin AK • Untersuchung des Auftretens von SLE • Entwicklung von Glomerulonephritis • Nierenfunktion • Proteingehalt im Urin • histologische Untersuchung der Leber

45. Derzeitige Arbeit • Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend), CD22 und CD72 • Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren • Klonierung von miRNA/shRNA • Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen FcgRIIB, CD22, CD72 Aktivierende FcgR Effektivitätstest der miRNA/shRNA(positive Kontrolle) miRNA/shRNA sollten keinen Einfluss auf diese haben (negative Kontrolle)

46. Vielen Dank für die Aufmerksamkeit