Ovčije At specifično za humani IgG (ovčije anti-humano IgG antitelo)

1. Šta je antiserum? Šta su polikloska At? Šta su monoklonska At? Šta su adjuvansi? Koji je osnovni princip tehnologije dobijanja monoklonskih At? Ovčije At specifično za humani IgG (ovčije anti-humano IgG antitelo) Zečije At specifično za humani C4 (zečije anti- humani C4 antitelo) Kozije At specifično za mišiji Ig (kozije anti-mišiji Ig antitelo) Mišije At specifično za humani CD4 (mišije anti-humani CD4 antitelo) 1. Koje od navedenih je monoklonsko At? 2. Opisati dobijanje svakog od ovih antitela. 3. Koja 2 At od navedenih će međusobno odreagovati ako se nađu u istom rastvoru? Koje At će se vezati za koje At i za koji njegov deo?

2. PRECIPITACIJA

3. PRECIPITACIJA: • reakcija između solubilnog Ag i specifičnog At • - izukrštano povezivanje u trodimenzionalnu mrežu koja se izdvaja u vidu taloga • stepen precipitacije zavisi od odnosa broja molekula Ag i broja molekula At • samo pri određenom odnosu Ag i specifčnog At –EKVIVALENTI (OPTIMALNI) – maksimalno međusobno povezivanje i stvaranje velikih nerastvornih kompleksa koji PRECIPITIRAJU • - ako su ili Ag ili At u višku = stvaranje SOLUBILNIH kompleksa- FENOMEN PROZONE • - odvija se u 2 faze: • I faza: specifično vezivanje Ag i At • II faza: stvaranje vidljivih agregata • traje satima ili danima • na nju utiču : koncentracija jona, pH, T, vreme

5. antitelo antigen zona viška antitela zona ekvivalencije zona viška antigena antitela + + + - - - - - supernatant antigeni - - - - - + + + precipitat količina precipitata količina dodatog antigena Precipitaciona kriva

6. Precipitacione metode: - za detekciju, identifikaciju i merenje solubilnih Ag ili At - u kliničkoj imunologiji za ispitivanje proteina plazme i tkivnih tečnosti (normalnih i abnormalnih imunoglobulina) • PODELA: • metode u tečnom medijumu (interfacijalni test prstena, nefelometrija) • metode u polučvrstom medijumu (dvostruka imunodifuzija, RID, • imunoelektroforeza, raketan elektroforeza, protivstrujna elektroforeza)

7. METODE U TEČNOM MEDIJUMU: INTERFACIJALNI TEST PRSTENA - kvalitativna tehnika za brzu detekciju solubilnog Ag ili At u serumu

8. detektor rasejane svetlosti rasejana svetlost nerasejana svetlost izvor svetlosti • NEFELOMETRIJA • kvantitativna, savremena metoda za brzo merenje koncentracije solubilnih Ag (proteina) u biološkim tečnostima • imunski kompleksi dovode do zamućenja rastvora povećano prelamanje svetlosnog zraka iz lasera • stepen rasipanja direktno proporcionalan konc. Ag • - merenje konc. Ig ( IgG, IgM, IgA), komponenti sistema komplementa (C3, C4, faktor B), C-reaktivni protein (CRP) i dr. Nefelometrija

9. METODE U POLUČVRSTOM MEDIJUMU (GELU): • reakcija Ag i At u gelu (agar, agaroza) • - precipitat u vidu precipitacione linije na mestu ekvivalentog odnosa • DVOSTRUKA IMUNODIFUZIJA • RADIJALNA IMUNODIFUZIJA (RID) • IMUNOELEKTROFOREZA • RAKETNA ELEKTROFOREZA • (JEDNODIMENZIONA JEDNOSTRUKA ELEKTROIMUNODIFUZIA) • PROTIVSTRUJNA ELEKTROFOREZA • (JEDNODIMENZIONA DVOSTRUKA ELEKTROIMUNODIFUZIA) • UNAKRSNA IMUNOELEKTROFOREZA primena el. struje

10. Ag specifično At DVOSTRUKA IMUNODIFUZIJA (OUCHTERLONYEVA ANALIZA) - kvalitativna ili semikvantitativa metoda - Ag i At iz naspramnih rezervoara u gelu agara slobodno difunduju u svim pravcima; na mestu ostvarivanja ekvivalnentnog odnosa- stvaranje precipitacione linije - mogu se koristiti mono- ili polispecifični antiserumi (mono- ili multipli Ag-At sistemi)

12. a) b) c) antitela specifična za determinante 3, 4 i 5 na antigenu antitelo specifično za antigen 1 antitelo specifično za antigen 1 antitelo specifično za antigen 2 antigen 1 antigen 1 antigen 1 antigen 2 antigen sa determinantama 3, 5 antigen sa determinantama 3, 4 i 5 humani serum polispecifični antiserum na proteine humanog seruma humani albumin zečiji γ globulin humani γ globulin Dvostruka imunodifuzija u gelu: reakcije identičnosti, neidentičnosti i parcijalne identičnosti antigena Dvostruka imunodifuzija

13. antigen 1:2 antigen 1:4 antigen antitelo specifično za antigen antigen 1:8 antigen 1:16 antigen 1:32 Dvostruka imunodifuzija kao semikvantitativna metoda

14. RADIJALNA IMUNODIFUZIJA (RID) • - kvantitavna tehnika • Ag iz rezervoara radijalno difunduje kroz gel u koji je prethodno inkorporisano At specifično za Ag • -precipitacioni prsten na mestu ekvivalentnog odnosa • - površina prstena je direktno srazmerna količini Ag • - za merenje konc.: Ig, C3, C4, faktor B, C1 inhibitor, albumini, a-makroglobulin, CRP itd.

15. 3 1 2 4 5 6 3 4 2 kalibraciona kriva kvadrat prečnika prstena (mm2) 5 6 1 koncentracija IgG (mg/ml) Merenje konc. IgG u serumu RID-om

16. IMUNOELEKTROFOREZA • - kombinacija zonske elektroforeze i dvostruke imunodifuzije • - za kvalitativnu analizu antigenskih smeša • danas: dokazivanje mijelomskih proteina (multipli mijelom) monoklonskih Ig i • Bence-Jonesovih proteina (monoklonski kapa ili lambda lanci) I zonska elektroforeza- razdvajanje proteina na osnovu naelektrisanja Proteini seruma (5 frakcija): albumin, α1, α2, β, γ globulini

17. normalni serum albumin α1 α2 β γ albumin α1 α2 β γ IgG mijelom sa γ šiljkom i sniženim albuminom albumin α1 α2 β γ albumin α1 α2 β γ Zonska elektroforeza normalnog humanog seruma i seruma pacijenta sa IgG mijelomom

18. a) b) - + c) d) e) II dvostuka imunodifuzija I II Imunoelektroforeza humanog seruma

20. Imunoelektroforezom dobijeni precipitacioni lukovi za najvažnije proteine humanog seruma ukupni proteini seruma prealbumin albumin α1 lipoprotein α2 makroglobulin βlipoprotein transferin IgM IgG fibrinogen IgA Imunoelektroforeza humanog seruma kriterijumi za “čitanje” imunoelektroforeze: -reakcija proteina (Ag) sa At " ima-nema" -elektroforetska pokretljivost proteina "normalna-izmenjena" -mesto formiranja precipitata u odnosu na kanal-"normalno-izmenjeno" -oblik i izgled precipitacione linije

21. RAKETNA ELEKTROFOREZA (JEDNODIMENZIONA JEDNOSTRUKA ELEKTROIMUNODIFUZIA) - kvantitativna metoda - agarozni gel je uniformno inkorporisan monospecifičnim At; - u rezervoarima je Ag koji migrira pod dejstvom el. struje; precipitat u obliku dugačkog pika (rakete)čija je dužina proporcionalna koncentraciji Ag

24. PROTIVSTRUJNA ELEKTROFOREZA (JEDNODIMENZIONA DVOSTRUKA ELEKTROIMUNODIFUZIA) - zasniva se na svojstvu većine proteinskih Ag da migriraju prema anodi, a γ- globulini ka katodi - princip: u rezervoaru na anodnoj strani –At, na katodnoj- smeša sa Ag; po uspostavljanju električnog polja migracija ka suprotnoj elektrodi; na mestu ostvarivanja ekvivalentnog odnosa-precipitacijska linija

25. UNAKRSNA IMUNOELEKTROFOREZA • ova metoda predstavlja kombinaciju elektroforeze i imunoelektroforeze • Ag se prvo razdvajaju elektroforezom u agaroza gelu bez At, pa se zatim gel iseče na trake i svaka se položi na čistu staklenu ploču, a gel, koji sadrži At za sve Ag se izlije nasuprot traci. (50-70 prec. lukova)