Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte

1. Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte

3. Taglioper mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm. • Montaggiodelle sezioni su vetrini per microscopia. Sezione non colorata

4. Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa consistenza può essere problematico -Ecco perché occorre INCLUDERE -Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni. PARAFFINA RESINA MIX DI PARAFFINA E RESINE

5. Colorazionedelle sezioni con il metodo più appropriato. • I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo. Colorazione automatizzata

6. Colorazioni • Colorazionecon un colore brillante di certe componenti del tessuto • Contro colorazionedel resto del tessuto con un colore contrastante

7. Ematossilina/Eosina • Ematossilinaha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). • Eosinaha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).

8. Perchè questa "slide" è blu … • Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila • È coloratadall'ematossilina • Nucleieribosomigeneralmente sono basofili

9. … e questa rossa ? • Se una porzione si colora inrosso /arancio /rosa, vienedettaacidofila o eosinofila • È colorata dall'eosina • Sono proteine del citosol

10. Altre colorazioni • PAS • Per sostanze ricche in zuccheri (muco) • Tricromica (Azan Mallory) * • Per i tessuti connettivi • Le fibre si colorano in blu • Con E&E sono rosa. Adiposo Bianco Le aree bianche sono lipidi

11. Cellule nervose Cellule del sangue Mielina • Osmio o Sudan black • Per grasso /lipidi/mielina • I lipidi non incorporano coloranti acquosi • Argento ed oro • Per fibre delicate e processi cellulari • Giemsa • Per le cellule del sangue • Simile ad E&E

12. Come si osserva il campione? • Attraverso un buon microscopio ottico • Fotografandolo • Misurandolo Per avere un'idea delle dimensioni delle strutture osservate si può usare come riferimento un eritrocita (˜ 8 micron)

13. Interpretate il campione!!! • Dovete pensare in3 dimensioni • Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

14. Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

15. Microscopia Elettronica a Trasmissione • Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta • Alta risoluzione • Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi • Gli elettroni passano attraverso il campione

16. MICROSCOPIA ELETTRONICA Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito. Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.

17. La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO: 2,000 Angstroms = 200nm Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitosi

18. Microscopia elettronica -I campioni devono essere molto più sottili di quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa -Non vengono usati coloranti ma sostanze dense agli elettroni semplicemente per dare contrasto o anche per marcare anticorpi

19. Preparatione del campione Cellula eucariotica Nucleo interfasico • Fissazione • glutaraldeide • Tetrossido osmio • Deidratazione • etanolo (passaggi) • Inclusione • Resine plastiche • Taglio • ultramicrotomo (spessore 50-100 nm) • Colorazione • Metalli pesanti

20. Preparazione di Campioni Biologici per TEM • 1 Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3) • 2Fissaggiodel campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio • L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) • Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari.

21. Disidratazionedei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo. Inclusionedei campioni in piccoli blocchi di resina.

22. Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro). • La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm. • Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm).

23. Montaggio delle sezionisu di una griglia. Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo. Visualizzazioneal TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

24. Vari tipi di Microscopia Elettronica • Transmissione (TEM) • Scansione (SEM) • Shadow-casting • Freeze-fracture • Freeze-etching • CryoEM • Negative Staining

26. Microscopia Elettronica a Scansione • SEM fa una scansione della superfice del campione • Produce immagini 3-D

27. IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM) Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronica) viene sfruttata l’interazione di un fascio di e- con il campione per ricavare informazioni sul campione stesso come nel microscopio luce a riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni

28. Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso

29. Tridimensionalità La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità - Ciglia e microvilli

31. Glomerulo renale

32. Preparazione dei campioni per SEM • Acquisizionedel campione • Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie • Fissazioneedisidratazione • Non si include

33. Poggiato su di un supporto e ricoperto con um metallo • Oro, cromo, palladio, carbone • Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso) • Visualizzato al microscopio • Fotografato • Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X