TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE PLANTAS

1. COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE UMA PLANTA COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE UMA PLANTA As estratégias mais utilizadas de transferência de DNA para plantas: – 1/3 da produção de trigo perde-se devido a: Ervas daninhas Pragas Doenças(resistência a herbicidas, pragas, doenças?...) – As quantidades de arroz que se perdem anualmente devido a infecções com o vírus Tungro davam para alimentar 15.000.000 de pessoas (introdução de resistência à virose?) –Anualmente 2.000.000 de crianças ficam cegas por falta de pró-vit. A (melhoramento do potencial nutritivo do arroz com enriquecimento em pró-vitamina A por introdução de genes da via biossintética dos carotenos, ß-caroteno?) Estratégia global: 1. N · Identificar o objectivo de P melhoramento Vector biológico: è Agrobacterium · (uma bactéria do solo com duas espécies importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes) Identificar e isolar o(s) gene(s) de M interesse è Vector não biológico: Bombardeamento · Clonar o(s) gene(s) num vector com micropartículas, de ouro ou tungsténio (com cerca de 1 mm de diâmetro) apropriado · Transferir o(s) gene(s) de èè O DNA entra através Transferência directa: interesse à planta è da membrana celular permeabilizada por choques eléctricos ou agentes permeabili- zantes (como o polietilenoglicol) · Avaliar a integração e o comportamento do(s) gene(s) na planta · Avaliar o comportamento da planta transgénica no terreno COCH COCH 3 3 COCH 3 OCH OCH H CO H CO 3 3 3 3 OH OCH OH H CO 3 3 OH A A A vir vir vir Agrobacterium desarmado F A B G C D E Bactéria com o Ti -plasmídio Cromossoma bacteriano ESTRATÉGIAS E PROBLEMAS DA ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS Identificação, isolamento e manipulação in vitro dos genes è Transferência dos genes manipulados para as células vegetais è EXEMPLOS DE ALGUNS PROBLEMAS ACTUAIS SOLUCIONÁVEIS POR ENGENHARIA GENÉTICA è Cultura das células para obter plantas trans- génicas ou linhas de células transgénicas, man- tidas in vitro como callus, suspensões ou raízes Indução pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormonas, 2 - síntese de opinas (compostos de carbono e azoto dos quais a bactéria se alimenta – 900 milhões de pessoas passam fome (este número cresce anualmente em 95 milhões) – Os oceanos e os terrenos de cultura são explorados aos seus limites – A quantidade de terra arável por pessoa diminui continuamente – As perdas de culturas por pestes, doenças e ervas daninhas atinge os 40-60% – As perdas anuais de arroz são superiores a 200 milhões de metros cúbicos, o equivalente a alimento para 1000 milhões de pessoas OBJECTIVOS DA ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS Resistência a insectos Resistência a herbicidas Resistência a doenças (vírus, fungos, bactérias) Expressão de proteínas importantes do ponto de vista farmacológico (i.e.: antigéneos) Inibição do amadurecimento de frutos Criação de esterilidade masculina Manipulação do metabolismo do carbono ou fósforo Melhoramento da absorção de ferro …… è è è è è è è è TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE PLANTAS M. Margarida Oliveira - Célula vegetal - Alvos possíveis de transformação genética: Núcleo (N) Plastos (P) (resistência a herbicidas do tipo triazina) Mitocôndrias (M) (cms - "cytoplasmic male sterility") Utilização laboratorial do Agrobacterium: Cultura in vitro do material vegetal (plântulas micropro- pagadas e germinantes) Ferimento do material vegetal (seccionamento) Representação esquemática do processo de infecção: Infecção dos explantes com a suspensão bacteriana (Acetosseringona - ou outros compostos produzidos pelas células vegetais feridas) Situação que ocorre na natureza: Leitura da absorvência a 600 nm Aplicação sobre a zona de ferida (24-48h) Colonização genética das plantas por infecção por Agrobacterium tumefaciens Receptor membranar Infecção de plantas feridas e transferência do Incubação numa solução diluída de bactérias (durante alguns segundos a alguns minutos) e transferência dos explantes para meio fresco para cocultura com as bactérias Agrobacterium (Molécula que vai activar a região de virulência) DNA para as células vir G vir G* Cultura em meio líquido com agitação (adição ou não de acetosseringona) Plasmídio Ti Região de virulência Indução de rebentos transformados em meio de cultura selectivo (por ex. com antibióticos de selecção) e na presença dos fitorreguladores adequados Ti -plasmídio Região excisada e transferida à planta, por informa- ção vinda da região de virulência (responsável pela virulência) Após a cocultura: - transferência dos explantes para meio de cultura fresco (com ou sem prévia lavagem em água ou meio cultura, ou secagem sobre papel de filtro estéril) - o meio fresco deve conter antibióti- cos para eliminar o Agrobacterium D D T-DNA Plasmídio Ti chv A chv B (genes ligação ao hospedeiro) A. rhizogenes Formação de raízes no material infectado. As raízes excisadas crescem e ramificam em meio de cultura sem hormonas Planta com agrobactérias vivendo em "crown gall" Plantas micropropagadas (amendoeira) utilizadas como fonte de material para regeneração adventícia e transformação genética Diferenciação de rebentos adventícios a partir de folhas em meio de cultura Plantas regeneradas de folhas transfor- madas, à esquerda uma plântula resis- tente ao antibiótico de selecção (canami- cina) e à direita uma planta sensível (não transformada) Monitorização da presença de um gene de referência introduzido por transfor- mação. Por incubação num substracto adequado, a enzima codificada pelo ge- ne dá origem a um produto de cor azul que permite identificar as células/plantas transformadas (à esquerda duas plantas transformadas e à direita 3 plantas controlo)