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Real Time PCR

Real Time PCR. Ｖｅｒ． 1.00. Real-Time PCR 法とは・・・. サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、 PCR での増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法です。 　本法は、電気泳動が不要で、かつ増幅が指数関数的に起こる領域で PCR 産物量を正確に定量できる利点があります。. 鋳型ＤＮＡ濃度が高い. 鋳型ＤＮＡ濃度が低い. threshold cycle （ Ct 値）. １． DNA 結合色素（ SYBR Green Ⅰ ）を用いる方法. 励起光. 励起光.

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Presentation Transcript

  1. RealTimePCR Ｖｅｒ．1.00

  2. Real-Time PCR法とは・・・ サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、PCRでの増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法です。 　本法は、電気泳動が不要で、かつ増幅が指数関数的に起こる領域でPCR産物量を正確に定量できる利点があります。

  3. 鋳型ＤＮＡ濃度が高い 鋳型ＤＮＡ濃度が低い threshold cycle（Ct 値）

  4. １．DNA結合色素（SYBRGreen Ⅰ）を用いる方法 励起光 励起光

  5. SYBRGreenⅠはDNAの副溝（minor groove)に結合します。

  6. 蛍光共鳴エネルギー移動現象 FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer)とは・・・． 励起された蛍光団 (Donor : D*) は，そのエネルギーを蛍光や熱エネルギーとして放出する． 特定の条件を満たす分子 (Acceptor : A) が存在すると，共鳴による励起エネルギーの移動 (FRET)が起こる．この時，エネルギーを失った Donor は基底状態にもどり，同時にエネルギーを受け取った Acceptor は励起状態となる．FRET は Donor Acceptor 間の距離が1-10 nm という，非常に広い範囲で起こることが知られている． D を励起し，FRET が起こると，励起状態の A を得ることができる．A が蛍光物質である場合，D を励起すると，（FRETが起こり）A が励起されるため，A からの蛍光を得ることが可能である．

  7. FRET がおこるために必要な条件 1.Donor の蛍光スペクトルと Acceptor の蛍光スペクトルの重なりがあること 2.Donor と Acceptor がある程度近くに存在すること 3.Donor と Acceptor が適切な配行を取っていること． 以上の３つを満たした分子の間で FRET は起こる．

  8. Ｄ Ｄ Ａ Ａ 2.ハイブリダイゼーションプローブを用いる方法 Ｄ：ドナー色素 Ａ：アクセプター色素 発光 オリゴヌクレオチドプローブ 励起光

  9. 3．TaqManプローブを用いる方法

  10. 励起光 励起光 参考文献 羊土社　ここまでできるＰＣＲ最新活用マニュアル タカラバイオ株式会社http://www.takara-bio.co.jp/index.htm

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