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Real Time PCR

Real Time PCR. Reaç ão de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots. O Que é?. SYBR Green TaqMan/FRET Molecular Becons LUX Scorpions outros. Tipos.

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Presentation Transcript

  1. Real Time PCR

  2. Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots. O Que é?

  3. SYBR Green TaqMan/FRET Molecular Becons LUX Scorpions outros Tipos

  4. Rápida ciclagem Alto Throughput Baixo risco de contaminação Muito sensível Larga faixa dinâmica Reprodutibilidade Quantificável Não é mais caro que PCR convencional Vantagens

  5. PCR

  6. Química da fluorescência TaqMan SYBR Green

  7. TaqMan Atividade 5’-Nuclease

  8. Atividade da Taq Nucleotídeo 5’ nuclease Síntese 5’ Taq 3’ Direção da síntese

  9. A Atividade 5’-Nuclease não altera a PCR

  10. TaqMan utiliza FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer

  11. TaqMan usa uma Probe Fluorescente Reporter Quencher

  12. Taq Extende do Primer Upstream

  13. A atividade 5’-Nuclease digere a Probe

  14. Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação Número de ciclos

  15. SYBR Green I Corante Minor Groove Binding. Sem probe; Custo mais baixo que TaqMan Menos que 0.5g de DNA na amostra. Não aceita multiplex.

  16. Especificidade TaqMan Alta especificidade, inerente a química. SYBR Green Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve”

  17. PCR quantitativo Expressão gênica transgênicos Quant. Câncer Qt patógenos

  18. Fases da PCR Plateau Linear Gel EtBr Log [DNA] Geométrica # ciclos

  19. Fase geométrica y = 2X

  20. Problemas nas fases linear e plateau Fase linear Efeito Plateau

  21. PCR Qt tradicionais Uso de competidores Compartilha mesmos primers. Competidor = tamanhos diferentes. Compartilhar mesmas condições. Métodos radio / ELISA. . Gráfico conc. . . Limite de número de ciclos. . .

  22. O Que faz o Real Time? A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade. São evitadas as fases linear e plateau.

  23. Calibração externa DNA/RNA são amplificados como uma curva separada para compensar a eficiência e fornecer unidades de quantificação target A Detection threshold target B Log [DNA] # ciclos

  24. Real-Time PCR Características do gráfico Real Time 0.90 Y=X(1+e)n 0.80 0.70 Amostra Plateau Alta CV baixa CV Rn Log [DNA] 0.60 Fluorescência Normalizadada ”reporter” (Rn) 0.50 0.40 Threshold 0.30 Geometric Controle sem Template Y=X2n 0.20 Baseline 0.10 Cycle # 0.00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 C T Número de ciclos PCR Fase geométrica CT é inversamente proporcinal a conc. de DNA

  25. Plot da Amplificação

  26. Curva Padrão y= -3.6x + 39 R2= 0.999 7 pg DNA 700 ng DNA

  27. OBRIGADO

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