1 / 29

Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek

Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek. Tomasz Sacha. Jesienna Szkoła Onkologii Falenty 21-23 października 2005. Aberracje cytogenetyczne w ostrych białaczkach. Zmiany numeryczne: Hipodiploidia (mniej niż 46 chromosomów) w 10-15% OBS Hiperploidia w 5-19% OBL, 2-3% w OBS

kaz
Download Presentation

Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek Tomasz Sacha Jesienna Szkoła Onkologii Falenty 21-23 października 2005

  2. Aberracje cytogenetyczne w ostrych białaczkach Zmiany numeryczne: • Hipodiploidia (mniej niż 46 chromosomów) w 10-15% OBS • Hiperploidia w 5-19% OBL, 2-3% w OBS Zmiany strukturalne (>200 powtarzalnych opisanych): • Bez uchwytnego związku z określonym typem białaczki - +8, -7, 7q- lub 5q- • Występujące częściej w określonych typach białaczek

  3. Aberracje cytogenetyczne w ostrej białaczce szpikowej – znaczenie rokownicze • t(15;17) PML-RARalfa, Mbcr i mbcr (M3), • t(8;21), AML-ETO (AML:20%, M2:40%)* 20-30% AML • inv 16, CBF-MYH11 (M4eo)* • kariotyp prawidłowy • kariotyp „inny”, złożone aberracje Korzystne rokowniczo Pośrednie ryzyko Niekorzystne rokowniczo

  4. Podział białaczek wg WHO I. Ostre białaczki szpikowe (OBS) • OBS z określonymi zmianami cytogenetycznymi t(15;17), PML/RARalfa+ (M3 wg FAB) t(8;21),AML/ETO + (M2 wg FAB) inv 16, CBFbeta/MYH1+ (M4eo wg FAB) 11q23, MLL z wieloliniową dysplazją • OBS o nieokreślonej specyfikacji cytogenetycznej (wg FAB) II. Ostre białaczki limfoblastyczne

  5. Użyteczność metod biologii molekularnej w diagnostyce ostrych białaczek • Bardzo heterogenna grupa osób z prawidłowym kariotypem, lub kariotypem „others” (np.40-60% AML) • Zmiany submikroskopowe: aberracje wewnątrzgenowe: duplikacje, mutacje punktowe, MLL,FLT3, c-KIT,RAS małe insercje lub delecje • Zmiana ekspresji genów: EVI1, BAALC, WT1

  6. Chromosom Philadelfia Powstaje gen hybryda Bcr/Abl Translokacja między chromosomami 9 i 22

  7. t(9;22)(q34;q11) in the course of CML YOUR LOGO HERE 4 5 1 2 3 6 8 9 10 12 7 11 17 13 14 15 16 18 21 22 19 20 X Y 7 Department of Haematology, Collegium Medicum Jagiellonian University, Kraków, Poland

  8. t(9;22)(q34;q11), BCR/ABL - FISH analysis 8 8

  9. e1’ e2’ b2 b3 e19 -bcr m-bcr M-bcr ABL Ib Ia a2 a3 a11 BCR e1 BCR-ABL e1a2 b2a2 b3a2 e19a2

  10. 10

  11. Stopień redukcji patologicznego klonu komórek stwierdzanego dostępnymi metodami badawczymi - poziomy (typy) odpowiedzi. 13 10 Diagnoza / nawrót 12 100 Remisja hematologiczna 10 Ph’ dodatni 11 10 10 Remisja cytogenetyczna (Ph’+ = 0) 10 1 10 Real-Time PCR dodatni 9 0.1 10 8 0. 01 10 Stosunek BCR-ABL / ABL (%) Całkowita ilość komórek białaczkowych 7 0. 001 10 Gniazdowa RT-PCR dodatni 6 0. 0001 Remisja molekularna 10 5 10 4 10 BCR-ABL niewykrywalny 3 10 2 10 10 0 0

  12. Zalety konwencjonalnego badania cytogenetycznego • Detekcja dodatkowych aberracji cytogenetycznych • Wykrywanie resztkowej populacji zdrowych komórek • hemopoetycznych • Określenie charakterystycznego polimorfizmu • chromosomalnego

  13. Anomalie cytogenetyczne zaostrzenia CML • Najczęstsze anomalie • trisomia 8 • izochromosom i(17) • trisomia 19 • dodatkowy chromosom • Ph’ • Rzadsze anomalie • monosomia 7 • monosomia 17 • monosomia Y • trisomia 17 • trisomia 21 • translokacja t(3;21) (q26;q22)

  14. Wady konwencjonalnego badania cytogenetycznego • Brak wykrywania Ph’ u ok. 10% chorych na CML • Trudności techniczne - wymóg uzyskania odpowiedniej ilości • dobrych jakościowo, dzielących się komórek. • Niska czułość

  15. Zalety hybrydyzacji immunofluorescencyjnej in situ (FISH) • Możliwość badania ilościowego • Analiza większej ilości komórek niż w klasycznej • cytogenetyce • Wysoka wiarygodność w ocenie odpowiedzi cytogenetycznej • Materiał: krew obwodowa

  16. Wady hybrydyzacji immunofluorescencyjnej in situ (FISH) • Wyniki fałszywie pozytywne • Badanie nieprzydatne gdy Ph’ w < 5-10% komórek

  17. Zalety i wady RT-PCR (reakcja odwrotnej transkrypcji i polimerazowa reakcja łańcuchowa) • Czułość: 10^-5 - 10^-6 - zaleta czy wada? • Konieczność szczególnej kontroli: wyniki fałszywie ujemne • wyniki fałszywie dodatnie • Wyniki negatywne mimo CML? • Trudności interpretacyjne: diagnostyczne • monitorowanie leczenia

  18. Introduction of Q-PCR for monitoring of Bcr-Abl Bcr-Abl after allo-SCT detected by RT-PCR 1 Bcr-Abl pos. 2 Bcr-Abl neg. 3 4 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 moths after allo-SCT • 1996 - ECMLSG: Q-PCR is appropriate method for Bcr-Abl monitoring • Real-time Q-PCR is recommended as a sensitive and accurate method of MRD monitoring in CML patients treated with imatinib

  19. Amplification plot of patient samples analyzed in Dept.of Haematology, Kraków by Real-Time Q-PCR AbiPrism 7700.

  20. Bcr-Abl kinetics in CML patients in Chronic Phase treated with Imatinib - Real-Time Q-PCR Comb.Th Transcript level vs positive control BC

  21. Metody ilościowej detekcji BCR/ABL - Q-PCR • Ilość transkryptu bcr/abl we krwi obwodowej silnie koreluje • z odsetkiem komórek Ph’ + w szpiku • Wzrastająca ilość transkryptu bcr/abl we krwi obwodowej • poprzedza wystąpienie nawrotu cytogenetycznego i • hematologicznego.

  22. Metody ilościowej detekcji BCR/ABL - Q-PCR • Informacja o wzroście ekspresji BCR/ABL krytyczna dla • pacjentów z alternatywnymi możliwościami leczenia (auto-, • mini allo-, standardowa allotransplantacja, inne) • Informacja o minimalnej ilości komórek białaczkowych • istotna w przewidywaniu długotrwałej kontroli choroby • Wartość prognostyczna ilości bcr/abl we krwi obwodowej • po 3 miesiącach terapii Imatinibem dla uzyskania odpowiedzi • cytogenetycznej (redukcja >3 log) 22

  23. Potencjalne mechanizmy oporności na imatinib Wzrost komórek niezależny od aktywności Bcr-Abl Wzrost komórek zależny od aktywności Bcr-Abl Amplifikacja/ hiperekspresja genu BCR-ABL Wtórne zaburzenia genetyczne Mutacje w domenie kinazy Imatinib Bcr-Abl Zmutowana Bcr-Abl Ewolucja klonalna von Bubnoff et al. Leukemia. 2003;17:829.

  24. “P loop” Miejsca mutacji w obrębie domen kinazy Y253F E355G M244V M351T Q252H Q252H L248V F317L F359V E255V E255K G250E T315I H396R S417Y E459K F486S E279K Miejsce wiązania ATP Pętla aktywacyjna koniec karboksylowy Ilość pacjentów z daną mutacją Różne mutacje tego samego aminokwasu

  25. Zależność pomiędzy występującą mutacją BCR-ABL a fazą CML French Cooperative Study Group (2004) CP AP p BP n=52 n=17 n=10 P-loop 19% 47% 0.028 50% T315l 15% 18% ns 40% Inne 66% 35% 0.029 10% • średni czas trwania leczenia imatinibem 30 mcy (2-54) • średni czas monitorowania leczenia 42 mce (4-54)

  26. Występowanie mutacji BCR-ABL a progresja CML French Cooperative Study Group (2004) Progresja (def): zgon, faza akceleracji, faza kryzy blastycznej P-Loop i T315L Inne p (n=18) (n=34) Progresja 61% 26,5 0,019 11/18 9/34 P-Loop T315L Inne p (n=8) (n=10) (n=24) Progresja 50% 75% 26,5 ns 5/10 6/8 9/34

  27. Pokonanie oporności poprzez zwiększenie dawek imatinibu French Cooperative Study Group (2004) Oceniani pacjenci odpowiedź (czas) 1/10 (10%) CHR: 1 (2.5 mo) MCR: CCR: P-loop 10/18 (56%) E255K 0/6 CHR: MCR: CCR: T315I 6/11) (55%) 11/24 (46%) Inne 24/40 (60%) (M244V,E275K,M351T F359V,V379I,L387M, H396R) CHR: 7 median 16,1(6,2-29) MCR: 2 10 i 21,5 mcy CCR: 2 9 i 18 mcy

  28. t(15;17) t(9;22) inv(16) Schoch et al. PNAS, 99, 10008-13, 2002

  29. t(9;22) t(15;17) inv(16) t(11q23)/MLL Kohlmann et al. GCC, 37, 396-405, 2003

More Related