Istorijat, građa DNK

1. StrukturaifunkcijagenetičkogmaterijalaBiohemijska genetika – molekularnagenetika Istorijat, građa DNK

2. Biohemijska genetika - grana genetike koja proučava biohemijsku strukturu naslednosti i promenjivosti u živom svetu.Molekularna genetika – grana genetike koja izučava nasledne promene na molekularnom nivou i utvrđuje mahanizme regulisanja aktivnosti gena.

3. Istorijat razvoja biohemijske genetike • Friedrich Miescher (1868) • Izolacija nukleinskih

4. Garrod (1908) Urođene greške metabolizma metabolizam fenilalanina (fenilketonurija) Istorijat razvoja biohemijske genetike

5. DNK-faktor transformacije u Pneumococcus-u • Griffit (1928) • Transformacijapneumokoka • Kod Pneumococcus-a prvi put dokazano da je DNK nosilac naslednog materijala svih prokariota i eukariota. • postoje 2 tipa Pneumococcus-a • Rezistentni na antibiotike-patogeni (virulentne)- • Senzitivni - osetljivi na antibiotike

6. Griffit-ov eksperiment • Griffit (1928) je proučavajući prouzrokovače pneumonije kod miša zaključio da se nepatogene R ćelije transformišu u patogene pomoću zagrevanja odnosno “ubijanja” S ćelija. • Pri zagrevanju dolazi do razlaganja DNK, i njenom kontrolisanom estrakcijom i prenošenjem 1 u 2 ćeliju menjane su osobine. • Time je Griffit pokazao mogućnost transformacije gena, ali nije uspeo da utvrdi biohemijsku strukturu te aktivne genetičke supstance.

8. Beadle & Tatum (1941) Jedan gen- jedan enzim Nobel 1958 Istorijat razvoja biohemijske genetike

9. Avery, Macleod and McCarty (1943) • DNK je nosilac nasledne informacije

10. Avery, Macleod i McCarty –ev eksperiment • Nastavili istraživanja Griffita na Pneumococcus-u • Iz patogenog (S) soja izdvojili su DNK i stavili je u sredinu gde žive nepatogeni sojevi (R) i ubrzo su se pojavile i ćelije patogenog soja (S). • Ogled je pokazao da DNK ima aktivnu ulogu u naslednosti i da je nosilac genetičkih informacija.

11. A. D. Hershey and Martha Chase -Pružili dokaz da je DNK nasledni materijal. Eksperiment su radili na nemarkiranoj E.coli koju su inficirali bakteriofagom

12. Hershey i Chase eksperiment • 1952. dokazali da DNK virusa ulazi u ćeliju domaćina i vrši transformaciju – razlaže njen unutrašnji sadržaj i stvara mnoštvo novih ćelija virusa. • U podlogu gde se gajene bakteriofage stavljeni su radioktivni izotopi P32 i S35i utvrđeno je da se oni ugrađuju u proteine (S) i DNK virusa (P) Pružen je direktan dokaz da je DNK genetički materijal bakteriofaga i ujedno je potvrđena uloga DNK u nasleđivanju

13. Watson, Crick (1953) DNK je dvolančana zavojnica Nobel 1962

14. Transkripcija Translacija Centralna dogma molekularne biologije • Crick & Gamow (1957) DNK RNK Protein Replikacija

15. Arthur Kornberg (1958) izolovao DNK polimerazu-enzim koji sintetiše novi lanac DNK na osnovu postojećeg koji služi kao matrica. Umnožavanje DNK u epruveti

16. Paul Berg (1972) Otkrio i izolovao restrikcione enzimekoji seku mol DNK na tačno određenom mestu (kao makaze) a zatim upotrebio enzim ligazu (lepak) da bi ponovo spojio isečene delove i tako napravio prvu veštačku-rekombinovanu DNK. Kary Mullis (1985) otkrio PCR- metod za indentifikaciju DNK fragmenata nastalih delovanjem restrikcoinih enzima. Otkrića koja su omogućila dalji razvoj biotehnologije

17. Nukleinske kiseline • Nukleinske kiseline su polimeri nikleotida • Sastavljeni su od: • azotne baze • šećera pentoze • ostatka fosforne kiseline • Postoje dva tipa nukleinskih kiselina DNK RNK

18. Funkcija DNK DNK sposobna da se: • reprodukuje u indentičnom obliku • prenosi nasledne informacije na potomstvo • menja se povremeno (mutacije)

19. Hemijski sastav i struktura DNK N U K L E O Z I D NUKLEOTID 5’ 3’ Šećer Azotne baze Purinske - Adenin (A) Guanin (G) Pirimidinske - Timin (T) Citozin (C) 3’ 5’ Ostatak fosfatne kis. A T C G G C T A

20. NUKLEOTID NUKLEOZID

21. Struktura DNK Azotna baza je N-glikozidnom vezom povezana sa pentozom, pri čemu se N-1 atom pirimidinske, odnosno N-9 atom purinske baze povezuje sa hidroksilnom grupom C-1 atoma pentoznog šećera. Azotna baza i šećer čine nukleozid. Fosfatna kiselina je povezana estarskom vezom sa OH grupom na C-5 atomu pentoze, gradeći fosfatni estar nukleozida tj. nukleotid. N1 N-9

22. DNK je dvočlani molekul (dvostruki heliks, zavojnica). Bazni parovi se naslojavaju jedan iznad drugih i međusobno su udaljeni 0.34 nm. Deset baznih parova (Bp)pravi pun okret (360 stepeni) u dvostrukom heliksu. Bp povezani su hidrogenskin vezama. Nasuprot baznim parovima koji se nalaze unutar mol DNK, prema periferiji postoji fosfodiestarska veza (izgrađena od fosfata i šećera koji se naizmenično smenjuju. Lanci DNK međusobno su anti paralelni (5’ kraj jednog lanca nalazi se naspram 3’ kraja drugog i obrnuto. Struktura DNK 3’ 5’

23. Struktura DNK • Struktura DNK može biti: • PRIMARNA – broj i redosled nukleotida u jednom lancu • ctgaattgcatggtactgacctgagt • SEKUNDARNA – dva, duga komplementarna lanca međusobno povezana vodoničnim vezama • 3. TERCIJARNA – višestruko ispresavijana • i smeštena u mali prostor jedra ćelije SEKUNDARNA struktura DNK

24. Struktura DNK

25. Chargaff-ova pravila (1950) • Hemijska ispitivanja koje je vršio Chargaff su pokazala da DNK pokazuje dovoljnu hemijsku složenost koja je neophodna genetičkom materijalu. • Chargaff-ova pravila su potvrdila da genetička specifičnost svake biološke vrste počiva na broju i redosledu nukleotida u primarnoj strukturi DNK. • Chargaff-ova pravila glase: Broj adeninskih nukleotida jednak je broju timinskih nukleotida (A=T), a broj guaninskih nukleotida jednak je broju citozinskih nukleotida (G=C) Zastupljenost guaninskih i citozinskih nukleotida odnosno adeninskih i timinskih nukleotida karakteristična je za svaku biološku vrstu.

26. Chargaffova pravila A = T G = C A + G = T + C A + T G + C %(G+C)  const.

27. Otkriće sekundarne strukture DNK

28. DIFRAKCIJA X-ZRAKA Fotografija dobijena difrakcijom X-zraka na molekulima DNK

30. Watson-Crick-ov model strukture DNK • Model se zasnivao na 4 dokaza: • Da se DNK sastoji iz nukleotida (povezanih fosfodiestarskim vezama) • Da sastavi baza slede Chargaff-ova pravila • Pažljivo zagrevanje nativne DNK može izazvati vidljivu promenu njenim fizičkim osobinama u cilju dobijanja tkz. DENATURISANE DNK ali bez kidanja kovalentnih veza. • Difrakcija vlakana DNK pomoću X - zračenja potvrđuje spiralnu odnosno helikalnu strukturu njenog molekula

31. Watson-Crick-ov model strukture DNK “Naš model dezoksiriboukleinske kiseline zapravo je par kalupa komplementarnih jedan drugome. Zamišljamo da se pre udvostručavanja vodonične veze prekinu, a dva lanca odmotaju i odvoje. Tada svaki lanac služi kao kalup-matrica na kom se stvara novi lanac, tako da na kraju nastanu dva para lanaca tamo gde je pre bio samo jedan. Štaviše, sled parova baza tačno će se udvostručiti.”

32. Šta čini strukturu DNK nezamenjivom u procesima naslednosti? • Jednostavna građa- izgrađena je od samo 4 nukleotida • Mala verovatnoća greške • Linearnai vrlo stabilna struktura, jedino visoka temperatura utiče na denaturaciju DNK. Visoka stabilnost DNK heliksa proističe od velikog broja vodoničnih veza između baznih parova. • Komplementarnost azotnih baza u dvojnoj spirali DNK omogućava da se na dve jednostruke spirale izvrši dogradnja i obrazovanje 2 nove istovetne dvostruke spirale.

33. Konformacija DNK menja se ( u jednu od 3 forme) zavisno od fizičko – hemijskih uslova i interakcije sa molekulima u okruženju. Cik-cak Uvijena nalevo Ima 12 bp po okretu U proseku 10.4 bp po jednom okretu 11 bp po okretu ne postostoji u in vivo uslovima

34. Tabela: Broj parova nukleotida, masa i dužina DNK u hromozomima haploidnih ćelija nekih vrsta organizama Što se organizam nalazi na većem stupnju evolutivne lestvice, sadrži više DNK. ????? (daždevnjaci 20× više od ljudi, višak DNK usporio njihovu evoluciju) Genomi prokariota i eukariota se razlikuju po broju ponovljenih nizova nukleotida.

35. DNK – nosilac genetičkih informacija u ćeliji • DNK u vidu genetičkog zapisa (kod = šifra) prenosi nasledne informacije iz generacije u generaciju To se postiže: • Udvajanjem(duplikacijom = replikacijom) DNK U toku udvajanja može doći do greške-genske mutacije. • Prepisivanjem(transkripcijom) obaveštenja sa molekula DNK na molekule iRNK • Prevođenjem(translacijom) tih obaveštenja sa jezika RNK na jezik aminokoselina, od kojih postaju proteini

36. Replikacija DNK Najvažnije svojstvo mol. DNK pri ćemu se od jedne originalne DNK stvaraju 2 indentične kćeri. (Polukonzervativni tip replikacije)

37. Posebni modeli DNK replikacije Konzervativni tip replikacije roditeljska DNK se potpuno održava a mol “kćeri” su novosintetisani. Disperzioni tip replikacije obe DNK mol “kćeri”se sastoje od novosintetisane DNK, dok se roditeljsaka DNK razgrađuje. Polukonzervativni tip replikacije kod roditeljske DNK dolazi do razdvajanja traka (pucanje H veza), a zatim svaka traka služi kao osnova za obrazovanje po 1 nove trake – po principu komplementarnosti

38. Replikacija • Replikacija se odvija na replikacijskoj viljušci i u njoj učestvuju oba lanca. U sintezi učestvuju enzimi: • DNK i RNK polimeraze, • egzonukleaze, • DNK ligaza • helikaza koja odmotava molekul DNK. • Enzimi helikaze kidaju vodinične veze između N baza dvostrukog lanaca u molekulu DNK. • Odmotavanje lanca pomaže SSB protein koji drži lance odmotane da se ponovo ne vežu (spetljaju).

39. Replikacija • RNK polimeraza (primaza) stvara RNK-prajmere (kratke segmente od 30 nukleotida; čije prisustvo je uslov za delovanje DNK polimeraze). DNK polimeraza (DNK polimeraza I) sintetiše nove lance u smeru 5---3 • Roditeljski lanac DNK koji je 5---3 smera služi kao predložak-osnova za sintezu kratkih delova novog lanca DNK tzv. okazaki fragmenti, koje enzim DNK-ligaza spaja u tzv. zaostajući lanac (koji će imati 3---5 smer). Dva dobijena lanca savršeno su identični, ali se ponekad u tom procesu mogu pojaviti i greške (mutacije). • DNK se sastoji od jednog originalnog lanca i jednog lanca koji je novo sintetisan. To se naziva semikonzervativna replikacija.