ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA

1. ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA DUDI HARDIANTO 23 JANUARI 2007

2. PENDAHULUAN • DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari dioksiribonukleotida (dari basa purin atau pirimidin, gula pentosa,dan fosfat). • Basa purin: A,G • Basa pirimidin: C,T • DNA merupakan komponen penyusun kromosom ( materi penyimpan informasi genetik)

3. Komponen DNA Pasangan A-T G-C

4. DNA berada dalam sel sehingga untuk mendapatkanya harus merusak dinding dan membran sel

5. TAHAPAN ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA 1. Perusakan dinding dan membran sel 2. Inactivasi Enzim DNA-se 3. Purifikasi DNA dari komponen lain • Ekstraksi/presipitasi • Kromatografi Adsorpsi

6. Perusakan dinding dan membran sel • Tahap 1: • Merusak dinding sel: • mekanik (digerus) atau mesin micro smash • -enzimatik (bakteri: lisozim), (kapang:kitinase & selulase) mesin micro smash

7. Tahap 2: Ekstraksi dengan buffer ekstraksi/lisis Buffer ekstraksi/lisis berfungsi: 1. Merusak membran sel 2. Menginaktivasi enzim DNA-se 3. Menghilangkan kontaminan lain • Contoh Buffer ekstraksi/lisis: • Buffer TES ( Tris-HCl pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 0,5M , SDS 1%)

8. Tahap 3: Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi Tahap 1:Ekstraksi dg pelarut organik Campur sama banyak dg pel. organik Aqueous sentrifugasi Fasa air dipisah e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Interphase Organic Larutan DNA Hasil sentrifugasi dari ekstrak buffer lisis supernatan :mengandung DNA dan kontaminan Fasa air mengandung DNA, fasa pel. Organik mengandung protein dan lemak, debris sel mengendap

9. Tahap 3: Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi Tahap 2:Pengendapan DNA After Supernatant 70% EtOH Sentrigugasi Wash Centrifuge Pellet Larut pelet (H2O, Buffer TE • Pellet DNA • Cuci dg etanol 70% untuk menghilangkan garam dan kontaminan lain • Keringkan + alkohol dan garam (NaOAc &EDTA) untuk mengendapkan DNA

10. Tahap 3: Purifikasi dg Kromatografi adsorpsi

11. Tahapan kromatografi adsorpsi DNA dan kontaminan akan berikatan dengan silika Silika dicuci untuk menghilangkan kontaminan Silika dielusi untuk mendapatkan DNA

12. Penentuan kualitas dan kuantitas DNA

13. Nucleic Acid Analysis via UV Spectrophotometry DNA Absorption Spectra DNA mempunyai puncak absorpsi pada panjang gelombang 260nm. Absorban 1,0 pada 260 nm sebanding dg 50 µg DNA/ml

14. Kemurnian DNA Perbandingan A260/A280 ratio is ~1.8 DNA murni Kurang dari1,8 terkontaminasi

15. ElektroforesisUntuk Visualisasi DNA Elektroforesis: Perpindahan DNA bermuatan negatif terhadap medium agarosa atau polakrilamid sebagai aksi dari arus listrik Komponen: • Gel agarosa 0.8-1% untuk mencek genom, 1,5-2% untuk fragmen DNA berukuran 200bp, poliakrilamid 40% untuk 1-300 pb • buffer (TAE= Tris-Borat-EDTA;TBE=Tris-Acetat-EDTA; TPE=Tris-Fosfat-EDTA) • Loading dye (sukrosa/gliserol dan bromofenol biru) • dan sampel DNA

16. ElektroforesisUntuk Visualisasi DNA • Aliran listrik untuk elektroforesis 50-100 V dg arah dari – ke + selama sekitar 30 menit. • DNA akan bermigrasi berdasarkan ukuran, yg paling kecil akan lebih cepat bermigrasi. • Ukuran fragmen DNA ditentukan dg standar yg sudah diketahui ukurannya.

17. Visualisasi DNA dg etidium bromida yg akan berpendar di bawah sinar UV. EtBr

20. SEKUENSING DNA • PENENTUAN URUTAN BASA PADA DNA • MELIBATKAN PRODUKSI SEPERANGKAT MOLEKUL/FRAGMEN DNA DENGAN BERBAGAI UKURAN YANG SEMUANYA DIMULAI DARI UJUNG YANG SAMA • FRAGMEN-FRAGMEN TERSEBUT DIPISAHKAN SATU SAMA LAIN MELALUI POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS (PAGE)

21. Teknik Elektroforesis DNA Elektroforesis gel agarosebanyakdigunakananalisis of DNA Gel elektroforesis gel merupakanprosedureuntukmemisahkanmolekuleberdasarkankecepatanbergerakmelalui gel dibawahpengaruhmedanlistrik . Elektroforesis gel agarosadigunakansecararutinuntukpreparasidananalisis DNA Kita akanmenggunakanelektroforesi gel agarosauntukmenetapkanadanyadanukuranhasil PCR.

22. • Jika diletakan pada medan listrik, DNA bergerak ke kutub positif (anode). H  O2  DNA - + Power • Gel agarose berpori-pori, DNA bergerak melewati Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1×1 µm)  • DNA bermuatan negatif. • Gel agarose digunakan untuk memperlambat memperlambat gerakan DNA dan terpisah berdasarkan ukurannya.

23. DNA - + Power Seberapa cepat DNA migrasi? Kekuatan medan listrik, bufer, konsentrasi gel agarose ukuran DNA! *DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg panjang elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya kecil besar Dalam gel agarose, DNA linier migrasi berbanding terbalik dengan log10 ukuran molekular.

24. Agarose D-galactose 3,6-anhydro L-galactose • Sweetened agarose gels have been eaten in the Far East since the 17th century. • Agarose was first used in biology when Robert Koch* used it as a culture medium for Tuberculosis bacteria in 1882 Agarose merupakan polimer linier diekstrasi dari rumput laut.

25. Membuat Gel Agarose

26. Gel agarose dibuat dengan mendidihkan serbuk agarose dalam larutan bufer. Bufer Labu utk mendidihkan Agarose

27. Electrophoresis Equipment Power supply Tutup Tangki Gel  Kabel  Casting tray Sisir Gel 

28. Gel casting tray & combs

29. Preparing the Casting Tray Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.

30. Agarose Larutan bufer Campur serbuk agarose dan larutan bufer. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer.

31. Membuat Gel Agarose Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri). Larutan itu dididihkan sampai jernih (kanan). Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve. ***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.

32. Menuangkan gel Diamkan larutan agarose mendingin (~60ºC) dan kemudian tuangkan dalam cetakan. Jangan sampai ada gelembung udara.

33. Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

34. Ketika dingin, agarose polimerisasi, membentuk gel yg fleksibel. Setelah dinging (30-45 minute) gel berwarna agak putih. Hati-hati copot sisir dan selotape.

35. Letakkan gel dalam alat elektroforesis.

36. DNA buffer     wells Anode (positive) Cathode (negative) Tuangkan bufer sehingga diatas gel +/- 1 mm. Cak setiap sumuran terisi bufer.

37. Preparasi Sample Campur sample DNA dengan bufer sampel. Ini memudahkan sampel masuk kedalam sumuran, karena adanya gliserol yg memperberat sampel. 6X Loading Buffer:   Bromophenol Blue (for color)  Glycerol (for weight)

38. Memasukkan sampel ke Gel Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.

39. Running the Gel Letakkan penutuo, hubungkan dengan kabel, hubungkan dengan power supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar - DNA migrasi ke anode (merah). Jika dihidupkan, terbentuk gelembung pada elektrode

40. Cathode (-)  wells  Bromophenol Blue DNA (-)  Gel Anode (+) Setelah dihidupkan, cek bahwa warna bergerak pada arah yg benar. Bromophenol blue bergerak serah dg DNA.

41.  12,000 bp  5,000 DNA migration  2,000  1,650  1,000  850  650  500  400  300  200  100 Standar tangga DNA - Note: bromophenol blue migrasi = 300 bp DNA bromophenol blue + Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs.

42. As an alternative to purchasing costly DNA ladders, one can be created using meal worm (Tenebrio molitor) DNA and a restriction enzyme. http://people.uis.edu/rmosh1/DNAexerciseVIIa02.pdf

43. Pewarnaan Gel • Etidium bromide interkalasi pada DNA dan berfluoresensi pada sinar UV, menyebabkan DNA terlihat pada Gel. • Etidium bromide dapat ditambahkan pada gel atau pada buf elektroforesis sebelum atau sesudah elektroforesis. ***PERHATIAN! Etidium bromide merupakanl mutagen kuat dan toksik. Sarung tangan harus dipakai setiap waktu.

44. Pewarna lain yg lebih aman •  Methylene Blue •  BioRAD - Bio-Safe DNA Stain • Ward’s - QUIKView DNA Stain • Carolina BLU Stain • …others keuntungan Tidak mahal Kurang toksik Tidak perlu sinar UV Tidak ada sisa bahan berbahaya kerugian Kurang peka diperlukan DNA lebih banyak pada gel Perlu waktu pewarnaan lebih lama

45. Pewarnaan Gel • Letakan gel pada nampan yang berisi larutan pewarna hangat. • Diamkan gel selama 25-30 minute. • untuk menghilangkan kelebihan pewarna, diamkan gel dalam air. • Ganti air beberapa kali supaya efisien.

46. Etidium Bromide sumber sinar ultraviolet untuk dapat dilihat

47. DNA ladder  DNA ladder  1 2 3 4 5 6 7 8 wells • 5,000 bp  2,000  1,650  1,000  850  650  500  400 PCR Product  300  200  100 + - - + - + + - Visualisasi DNA (etidium bromide) Primer dimers Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for Wolbachia DNA

48. Visualisasi DNA (QuikVIEW ) DNA ladder  wells  2,000 bp PCR Product  1,500  1,000  750  500  250 + - - - - + + - - + - + Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for Wolbachia DNA March 12, 2006