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Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires

Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii :. Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires. Thèse de Doctorat en Physique soutenue par Pauline RUFFIOT Sous la direction de Marie-France CESBRON-DELAUW et Antoine DELON.

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Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires

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Presentation Transcript

  1. Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii : Interactions des protéines GRA avec des vésicules unilamellaires Thèse de Doctorat en Physique soutenue par Pauline RUFFIOT Sous la direction de Marie-France CESBRON-DELAUW et Antoine DELON

  2. Pathogène responsable de la toxoplasmose: 50% de la population mondiale infectée; Formes graves chez les fœtus et les sujets immunodéprimés. Proche de Plasmodium falciparum, responsable de la malaria Hôtes définitifs: Félidés Reproduction sexuée Sporozoïte Mérozoïte Environnement Forme proliférative Forme dormante Bradyzoïte Tachyzoïte Hôtes intermédiaires: Mammifères et oiseaux Contexte biologique: T. gondii Toxoplasma gondii est un protozoaire eucaryote, appartenant au phylum des Apicomplexa: c’est un parasite intracellulaire obligatoire. Réactivation chez les sujets immunodéprimés Transmission verticale au foetus Toxoplasmose congénitale Encéphalite

  3. Un compartiment spécialisé au sein de la cellule-hôte, formé activement par le parasite 1. Attachement Sécrétion des micronèmes 2. Invasion Sécrétion des rhoptries 3. Maturation de la VP Sécrétion des granules denses 4. Prolifération des parasites 1µm [Lebrun et al.,2007] La vacuole parasitophore (VP) de T. gondii

  4. Les systèmes membranaires de la VP Parasite PVM PV Cellule-hôte [Coppens et al., 2006] [Magno et al., 2005a] HOSTs: Tubules séquestrant des organites de la cellule-hôte PVM: Membrane délimitant la VP RNM: Réseau de nanotubes membranaires Tubules de diamètre ~50nm sous-tendus par un microtubule de la cellule-hôte Tubules de diamètre 30-50nm

  5. Hélice amphipathique GRA1 Domaine transmembranaire GRA2 GRA3 GRA4 GRA5 GRA6 GRA7 GRA8 GRA9 La famille des protéines GRA Protéines de granules denses La plupart des protéines GRA contiennent un segment hydrophobe ou amphipathique, susceptibles d’interagir avec des membranes.

  6. Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Associées aux structures membranaires de la vacuole mature Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole

  7. Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Associées aux structures membranaires de la vacuole mature Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole

  8. RNM GRA2,4,6,9 HOSTs GRA7 PVM Lumen GRA3,5,7 Toutes GRA Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Associées aux structures membranaires de la vacuole mature Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole

  9. Essentiellement solubles Fraction luminale soluble Partiellement solubles Bien que contenant pour la plupart des domaines hydrophobes, les protéines GRA existent en partie sous des formes solubles tout au long de leur trafic post-sécrétoire. Trafic post-sécrétoire des protéines GRA Stockées dans les granules denses Libérées lors de la maturation de la vacuole Associées aux structures membranaires de la PV mature HOSTs RNM Lumen GRA2,4,6,9 GRA7 PVM Toutes GRA GRA3,5,7

  10. Rôle de GRA2 et GRA6 dans la formation du RNM • Rôle de GRA7 dans la formation des HOSTs ? [Coppens et al., 2006] GRA7 participe à un manteau cylindrique formé autour des membranes des HOSTs HOST Interactions des protéines avec les membranes de la VP [Mercier et al., 2002] RNM En l’absence de GRA6: Vésicules En parasite sauvage: Tubules homogènes En l’absence de GRA2: Matériel granulaire, non structuré GRA2 et GRA6 sont nécessaires à la mise en place du RNM

  11. Trafic post-sécrétoire Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles ? Association membranaire Quels sont les paramètres nécessaires pour l’association des protéines GRA aux membranes de la vacuole ? Formation de tubules membranaires De quelle manière les protéines sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs? Problématiques abordées

  12. Etude de la VP (LAPM) Physique des vésicules géantes (LSP) Protéines GRA Exploration des interactions membranaires et des fonctions des protéines GRA + Membranes modèles Modèle de la VP Biochimie (LAPM) Microscopie de fluorescence (LSP) Stratégie: Un modèle pour la VP

  13. Pas de protéines GRA purifiées -> Travail à partir de: 3 fractions ultrasolubles riches en protéines des anticorps spécifiques de chacune des protéines GRA. Protéines de parasites extracellulaires Protéines sécrétées in vitro Protéines de cellules infectées Milieu de culture complémenté de serum de veau foetal Formes solubles obtenues par ultracentrifugation (100 000g; 1h) Contraintes du système

  14. Membranes-modèles Lipides HeLa Les SUVs et GUVs ont été formées à partir d’un extrait lipidique total de cellules HeLa (cellules humaines), afin d’approcher la composition lipidique des membranes rencontrées dans la vacuole.

  15. Microscopie de fluorescence (LSP) Biochimie (LAPM) Présentation des résultats Travail sur SUVs En solution Travail sur GUVs Formes de solubilisation Association membranaire Déformations membranaires • Comparaison des différentes formes ultrasolubles des protéines GRA • Association spontanée • Répartition des protéines GRA • Implication des protéines GRA dans des déformations membranaires? • Association spontanée

  16. Protéines GRA suivies GRA1 Contrôle: hydrophile GRA2 2 hélices amphipathiques RNM GRA6 1 TMD GRA3 PVM 1 TMD PVM + HOSTs GRA7 1 TMD HOSTs RNM Lumen GRA2,4,6,9 GRA7 PVM Ttes GRA GRA3,5,7

  17. Biochimie • Analyse des formes solubles des protéines GRA par séparation isopycnique • Détermination des capacités d’association des protéines GRA avec des SUVs

  18. Top • Détection des protéines GRA • par immunoblot à l’aide • d’anticorps spécifiques Bottom 1 2 3 Analyse des formes solubles des protéines GRA Séparation isopycnique Protéines à analyser d=1.01 Gradient linéaire de glycérol d=1.13 Centrifugation jusqu’à l’équilibre (100 000g; 17h) Chaque protéine sédimente jusqu’à une densité isopycnique spécifique.

  19. Signature des protéines sécrétées in vitro 1.12 1.11 1.10 1.07 1.06 1.05 1.04 1.03 1.02 1.01 GRA1 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Analyse des protéines sécrétées in vitro

  20. Analyse des protéines GRA des différentes fractions Prot. parasite Prot. sécrétées Soluble GRA1 Prot. cell. infectée GRA2 ? GRA3 Protéines à domaines Transmembranaires: Formes plus agrégées dans le parasite GRA6 GRA7 Signatures des fractions de protéines: références pour les expériences d’association membranaire

  21. SUVs Association membranaire Protéines sécrétées in vitro + SUVs HeLa SUVs + Protéines Agitation douce 1h, 20°C Séparation isopycnique

  22. Les protéines GRA s’associent aux membranes HeLa Prot. parasite Prot. sécrétées GRA1 Prot. cell. infectée GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Les protéines GRA2,3,6,7, quelles qu soient leurs formes de solubilisation, sont capables de s’associer aux membranes HeLa

  23. Partenaires lipidiques de GRA2 -> GRA2 lie les phosphoinositides L’association de GRA2 et GRA6 aux SUVs dépend de leur composition SUVs HeLa + Protéines SUVs EPC + Protéines Incubation 1h, 20°C Ultracentrifugation différentielle (100 000g, 1h) S S P P Les protéines GRA2 et GRA6 sont capables de s’associer aux SUVs HeLa, mais pas aux SUVs EPC. -> Interactions spécifiques avec certains lipides? * EPC: phosphatidylcholine d’œuf * HeLa: extrait lipidique total de cellules HeLa

  24. Validation du système-modèle Les protéines GRA sécrétées contenant des séquences hydrophobes ou amphipathiques sont capables de s’associer spontanément à des membranes. Associées:GRA2, GRA3, GRA7 GRA6 SUVs HeLa Solubles:GRA1

  25. Microscopie de fluorescence Détection des protéines GRA par ImmunoFluorescence indirecte

  26. Réalisation d’une chambre d’électroformation à flux: Incubation protéines Electroformation Lavage 1h, t° amb Mode opératoire Formation des GUVs Association des protéines aux GUVs GUVs HeLa Marquage des protéines par immunofluorescence Incubation AC secondaire Incubation AC primaire Lavage Lavage

  27. Les protéines GRA s’associent aux GUVs HeLa GRA7 GRA2 GRA6 25µm 25µm 25µm GRA3 25µm • GRA2,6,7 se rassemblent en microdomaines protéiques à la surface. • GRA3 est répartie de manière beaucoup plus diffuse, bien que non homogène.

  28. GRA2 GRA7 25µm 25µm GRA3 GRA6 25µm 25µm Observation de GUVs groupées GRA2 et GRA7 sont particulièrement concentrées aux zones de contact entre GUVs -> Rôle dans jonctions membranaires?

  29. Les protéines GRA2 et GRA7 s’associent à des fils membranaires 25µm 25µm • GRA2 et GRA7 sont associées à des fils membranaires. • -> Rôle dans leur formation?

  30. Membranes des GUVs: GRA3 Bilan Micro-domaines protéiques: GRA2,GRA6,GRA7 Fils membranaires: GRA2 GUVs HeLa Réseau de fils ponctués: GRA7 Zones de contact: GRA2, GRA7 GRA2 et GRA7 présentent des caractéristiques particulières: elles sont concentrées aux zones de contact entre GUVs et présentes sur des fils membranaires.

  31. Discussion des résultats • Trafic post-sécrétoire des protéines GRA • Ciblage des protéines GRA aux membranes de la vacuole • Rôles des protéines GRA dans la formation des HOSTs et du RNM

  32. Densité isopycnique en gradient de glycérol 1.03 1.07 1.06 1.05 1.04 1.02 1.01 Protéines ultrasolubles parasitaires GRA1 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Protéines ultrasolubles sécrétées in vitro GRA1 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 GRA1 Protéines ultrasolubles de cellules infectées GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles?

  33. Densité isopycnique en gradient de glycérol 1.03 1.07 1.06 1.05 1.04 1.02 1.01 Protéines ultrasolubles parasitaires GRA1 Formes plus solubles Formes plus agrégées Formes transitoires GRA2 GRA3 GRA2 GRA6 GRA7 Protéines ultrasolubles sécrétées in vitro GRA1 GRA2 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 GRA1 Protéines ultrasolubles de cellules infectées GRA2 GRA2 GRA3 GRA6 GRA7 Comment les protéines GRA sont-elles solubilisées avant d’atteindre leurs membranes-cibles? Identification des protéines partenaires des protéines à domaine transmembranaire (GRA3,6,7) -> Braun et al., 2007

  34. Paramètre suffisants: (in vitro) Associées: GRA2, GRA3, GRA7 SUVs HeLa GRA6 SUVs HeLa + De parasite Sécrétée De cellule infectée Fractions solubles Paramètres nécessaires: Interactions spécifiques protéine-lipide ? Mécanisme de ciblage aux membranes de la vacuole Quels sont les paramètres nécessaires pour l’association des protéines GRA à des membranes ?

  35. Fusion de petites vésicules Stabilisation de la courbure Initiation de la déformation Stabilisation de la courbure Formation des HOSTs: Formation du RNM: Rôle de GRA2? Courbure spontanée locale - hél. amphipathique GRA2, - épingle TM GRA6 Poussée des microtubules de la cellule-hôte Charpentage par GRA7 Protéine vacuolaire ? De quelle manière les protéines GRA sont-elles impliquées dans la formation du RNM et des HOSTs?

  36. SUVs HeLa + GRA2 + GTP [Travail de Amina Bittame, Stage M2 2007] GRA2 suffit à déformer des SUVs en tubules! Bilan Très récemment au LAPM, GRA2 a pu être purifiée. • Mise en œuvre de méthodes permettant l’analyse des protéines GRA sous forme solubles • Validation du système-modèle: • Les protéines GRA, sous forme soluble, sont capables de s’associer spontanément à des membranes (SUVs ou GUVs) de composition lipidique adaptée. • Développement d’une méthode pour le marquage par immunofluorescence sur GUVs: • Détection des protéines GRA associées aux GUVs. • -> Possibilité d’application de techniques de spectroscopie de fluorescence

  37. Remerciements • Marie-France Cesbron-Delauw et Antoine Delon qui ont dirigé ma thèse, • Patricia Bassereau et Jean-François Dubremetz qui m’ont fait l’honneur d’être rapporteurs de ma thèse, • Annie Viallat qui a accepté de participer au jury de soutenance en tant qu’examinatrice, • Bertrand Fourcade qui a accepté de présider ce jury, • Toutes les personnes avec qui j’ai eu l’occasion de travailler et qui m’ont apporté leur aide, au LSP et au LAPM, mais également au Laboratoire de Génétique Moléculaire des Plantes, • Et particulièrement Corinne Mercier, qui m’a suivie tout au long de mon travail de thèse.

  38. Ouvertures:Etudes in vitro à partir de protéines GRA purifiées En membrane Etude des associations protéiques au sein de la membrane En solution Etude des cinétiques d’association des protéines GRA Spectroscopie de fluorescence Dichroïsme circulaire Biochimie (FCS) (FCS, FRET) Etude des changements de conformation Mode d’association membranaire Identification des protéines partenaires *FCS: Spectroscopie à corrélation de fluorescence

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