Les examens mycologiques

1. Les examens mycologiques Dr O. BELLON Hôpital d’Aix-en-Provence

2. Généralités • Le diagnostic d'une mycose, • suspectée par le médecin • confirmé • Par l'isolement au laboratoire du champignon responsable. • Par la sérologie pour les infections invasives • Le diagnostic mycologique comprend 4 étapes importantes : • le prélèvement, • l'examen direct, • la culture sur milieux appropriés, • l'identification des champignons isolés.

3. Les prélèvements • De la qualité de leur réalisation dépend la qualité du résultat • Peau et phanères • Prélèvement pour champignons kératophiles différent de celui des levures +++ • Dermatophytes : peau cheveux et ongles envahis (kératine) • Levures : formes suppuratives ++++ • plaies cutanées, • écouvillonner les lésions • ou ponctionner avec une aiguille stérile • ou faire une biopsie après avoir désinfecté la surface à l'aide d'un antiseptique. • Taches rouges • Biopsies de peau

4. Les prélèvements • Muqueuses et orifices naturels • Utiliser un écouvillon stérile. • Bien frotter les lésions apparentes. • Si l'examen ne peut être réalisé immédiatement, ajouter un peu d'eau physiologique stérile dans le tube. • Cas particuliers : • bouche : lésion végétante ou ulcéreuse : biopsie • anus: lésions squameuses : racler les squames en périphérie • vagin : faire le prélèvement sous spéculum • oreille : s'il existe un bouchon noirâtre, le prélever à la pince ou à l’anse de snelen

5. Les prélèvements • Prélèvements pulmonaires • crachats récoltés dans un récipient stérile après rinçage de la bouche avec un antiseptique. • Il est préférable de faire • des aspirations trachéales, • ou bronchiques sous fibroscopie, • ou des lavages broncho-alvéolaires.

6. Les prélèvements • Urines • milieu du jet • après désinfection soigneuse des parties génito-urinaires. • Selles • Mettre dans un récipient stérile. • Liquide céphalo-rachidien (LCR) et liquides divers • Prélever dans un tube stérile. • Sang • 5 à 10 m! de sang sur anticoagulant ou directement sur milieu de culture spécifique pour les champignons

7. Les prélèvements • Biopsies de tissus ou d'organes ou pièces opératoires • Séparer les prélèvements en deux. • Une partie fixée dans du liquide de Bouin ou du formol servira à l'examen anatomopathologique. • Une partie destinée à la culture sera mise dans de l'eau physiologique stérile (avec des antibiotiques si l'examen est différé).

9. Les prélèvements • Cheveux • Prélever en les arrachant les cheveux avec leur bulbe • Prélever les croutes et squames présents autour de la lésion • S’aider d ’une lumière de wood • Ne pas oublier d’associer un examen bactériologique en cas de suppuration

10. Examen direct • indispensable et souvent oublié ou négligé • oriente le diagnostic en fonction des éléments fongiques observés • fait suspecter ou confirme la pathogénicité du champignon isolé : Aspergillus fumigatus dans les crachats ++++++

11. Examen direct • Levures • éléments unicellulaires, ronds ou ovoïdes, • de taille variable (2 à 10 microns) • bourgeonnements, polaires ou latéraux • réfringentes avec des vacuoles ou des inclusions cytoplasmiques.

12. Examen direct • Filaments • Candida • filaments fins (2µ), • à parois non parallèles • avec des constrictions : pseudofilamentation • Trichosporon sp. • filaments fins (2-3µ) • à parois parallèles, • à cloisons perpendiculaires : vraie filamentation • Geotrichum sp • filaments épais (3-4 µ) • spores (8x4 µ) plus ou moins rectangulaires

13. Examen direct • Filaments • Aspergillus sp • filaments épais (4-5 µ) • divisions dichotomiques • ramifications à angle aigu • Septé • Mucorales • filaments irréguliers, • très épais {5-15 µ), • non cloisonnés, • Ramifications à angle droit

14. Examen direct • Cheveux • on reconnaît 5 types d'atteintes parasitaires. • 2 sont dites endothrix : • les éléments fongiques sont uniquement présents à l'intérieur du cheveu. • 3 sont dites endo-ectothrix : • les filaments sont à l'intérieur et à l'extérieur du cheveu.

15. Culture • Elle est absolument nécessaire pour l'isolement et l'identification des champignons. • Les milieux d'isolement simples • milieu de Sabouraud • milieu universel, • le plus simple : glucose (2 à 4 %), de la peptone et de l'agar • convient à pratiquement tous les champignons responsables de mycoses. • milieu de Sabouraud-chloramphénicol et/ou gentamycine • bactéries qui gênent l'isolement et l'identification. • milieu de Sabouraud-choramphénicol-actidione • l'actidione ou cycloheximide : inhibiteur des moisissures saprophytes. • associer ce milieu au précédent en particulier pour les prélèvements de peau, phanères, pulmonaires. • L'actidione inhibe également la croissance de certaines levures et sert alors de caractère d'identification.

16. Culture • Elle est absolument nécessaire pour l'isolement et l'identification des champignons. • Les milieux d'isolement colorés • Milieu de pagano • Sabouraud glucose avec chlorure de tetrazolium • Milieux chromagar • Milieu au bleu de méthyle • Les milieux d'isolement pour les hémocultures • dans la mesure du possible, milieux spécifiques des champignons • les milieux bactériologiques usuels ne sont pas suffisamment performants pour l'isolement des levures et tout particulièrement de Cryptococcus neoformans et de Candida glabrata.

17. Culture • Dans quelques cas précis, on utilise d'autresmilieux en complément du milieu de Sabouraud • milieu de Sabouraud + huile d'olive ou milieu de Dixon pour l'isolement de Ma/assez/a furfur ; • milieu Brain Heart agar pour l'isolement des dermatophytes exigeants ; • milieu Guizzotia abyssinica pour l'isolement spécifique de Cryptococcus neoformans.

18. Incubation • La lecture des cultures se fait : • après 24 heures et tous les jours pendant 8 jours pour les sangs et les LCR ; • après 5, 10 et 15 jours pour peau et phanères. • Conserver les tubes ou boites au minimum : • 8 jours pour les prélèvements d'origine pulmonaire ; • 15 jours pour les hémocultures • 1 mois pour les LCR, biopsies, peau, phanères et recherche de mycoses • 21 jours pour les infections invasives • Au total garder un mois

19. Examen des cultures • Noter l'aspect des colonies : • colonies crémeuses, lisses ou rugueuses : levures • de couleur blanc, beige ou rouge • Sur milieu ++++++ • colonies duveteuses, cotonneuses ou poudreuses : champignon filamenteux. • quantifier le nombre de colonies • rares : < 10 colonies • Quelques : 10 à 50 colonies • Nombreuses : > 50 colonies, bien isolées • Très nombreuses : > 50 colonies en nappe

20. Identification • Les techniques d'identification dépendent des champignons isolés. • Levures • Champignons filamenteux • Dans pratiquement tous les cas, le diagnostic est morphologique • examen macroscopique • examen microscopique

21. Examen macroscopique • vérifier que toutes les colonies sont identiques • Noter : • la consistance de la colonie : • glabre, • duveteuse, • poudreuse, • plâtreuse, • soyeuse, • laineuse, • floconneuse, etc. ; • L’aspect de la surface : • plane, • en dôme, • plissée, • cérébriforme ;

22. Examen macroscopique • vérifier que toutes les colonies sont identiques • Noter : • la présence de rayons • fins ou larges, • courts ou longs, • s'enfonçant dans la gélose, etc. ; • la couleur • du recto • du verso • la présence d'un pigment diffusible dans la gélose. • Attention aux milieux colorés ++++++++

23. Examen microscopique • Prélever un fragment de la colonie à l'aide d'une spatule • du centre vers la marge de la colonie • le déposer sur une lame avec 2 gouttes de liquide de montage • dilacérer légèrement le fragment en posant une lamelle sur la préparation et en écrasant doucement la gélose et la colonie.

24. Identification des levures • Aspect • Taille • Couleur • Filamentation • Milieux chromogènes • Galeries • Latex

25. Identification des levures

26. Identification des dermatophytes • Atteintes • épidermomycoses : peau glabre • teignes : cuir chevelu et poils • onyxis : ongles. • Exceptionnellement, ils peuvent envahir les tissus profonds. • peuvent être responsables de manifestations allergiques.

27. Identification des dermatophytes • Mode de végétation sur la peau • inoculation favorisée par une lésion cutanée préexistante • le champignon est actif à la périphérie de la lésion alors qu'il tend à disparaître du centre. • Mode de végétation dans le cheveu ou le poil • L'atteinte du cheveu est secondaire à l'atteinte cutanée : • le filament arrivant à un orifice pilaire progresse dans la couche cornée au contact avec le cheveu, le champignon soulève la cuticule et pénètre dans le cheveu qu'il envahit de haut en bas. • Sa progression s'arrête au niveau du collet du bulbe pilaire où il n'y a plus de kératine et forme une ligne appelée « frange d'Adamson ». • L'évolution du champignon dans le cheveu dépend de l'espèce responsable :

28. Identification des dermatophytes • Mode de végétation dans le cheveu ou le poil • les filaments se multiplient peu dans le cheveu qui reste relativement long (teigne favique) ; • les filaments se multiplient au point d'envahir entièrement le cheveu qui fragile, se casse au ras du cuir chevelu (teigne endothrix ) ; • les filaments ressortent du cheveu et forment autour de lui une gaine de petites spores très compactes (teigne microsporique), ou dissociées en chaînettes (teigne microïde) ou de spores plus grosses (teigne mégaspore). • Mode de végétation dans l'ongle • L'atteinte de l'ongle est secondaire à la pénétration du champignon dans la couche cornée de l'hyponychium et du lit unguéal. • La pénétration se fait dans un ongle déjà malade ou est favorisée par les microtraumatismes de l'ongle (ongle du gros orteil chez le footballeur). L'envahissement est progressif de la partie distale vers la partie proximale.

29. Identification des dermatophytes • Lésions de la peau glabre • Dermatophytie : (ex herpès circiné) • lésion ronde • àévolution centrifuge à partir du point d'inoculation ; • limitée par une bordure vésiculeuse ou squameuse dans laquelle se trouve le champignon. • Ces lésions sont très prurigineuses. • Dermatophytie des grand plis : (ex eczéma marginé de Hébra) • même extension centrifuge avec bordure active. • Intertrigo des petits plis interdigito palmaires ou plantaires : • L'atteinte plantaire est, soit isolée et vésiculosquameuse, soit généralisée à toute la surface de la paume des mains ou de la plante des pieds (kératodermie palmoplantaire). • Folliculites (ex granulome trichophytique de Majocchi) : • lésions nodulaires sous-cutanées dues àT. rubrum, favorisées souvent par des traitements aux corticoïdes ou par des épilations, siégeant de préférence sur la jambe.

31. Identification des dermatophytes • Teignes du cuir chevelu • TEIGNES TONDANTES • Elles se voient habituellement chez les enfants d'âge scolaire • guérissent spontanément à la puberté. • chez les adultes en cas d'immunodépression ou de traitement par corticoïdes. • Chez des mères d'enfants teigneux, peut exister un portage asymptomatique • . Les véritables lésions cliniques sont rares. • M. canis +++.

32. Identification des dermatophytes • Teignes du cuir chevelu • TEIGNES TONDANTES • On distingue : • les teignes microsporiques : • genre Microsporum, • grande plaque d'alopécie, peu squameuse. • Les cheveux parasités sont cassés courts (3 à 6 mm), • présentent un aspect « givré» et montrent une fluorescence verte sous lumière de Wood. • L'atteinte parasitaire des cheveux est de type microsporique. • les teignes trichophytiques : • dues à un champignon du genre Trichophyîon, • petites plaques d'alopécie, disséminées, très squameuses. • état pityriasique du cuir chevelu sans alopécie vraie. • Les cheveux parasités, cassés à ras du cuir chevelu sont englués dans les squames. • Ils ne sont pas fluorescents sous lampe de Wood • leur atteinte parasitaire est de type endothrix.

33. Identification des dermatophytes • Teignes du cuir chevelu • LA TEIGNE FAVIQUE • Due àTrichophyton schœnleinil, • elle se voit chez l'adulte jeune. • caractérisée par la présence du « godet favique » : • croûte friable, • jaune à odeur de souris. • Les cheveux sont fins, • décolorés, très rares. • Ils présentent une fluorescence vert-jaunâtre sous lumière de Wood • atteinte parasitaire de type favique. • L'alopécie est définitive en l'absence de traitement.

34. Identification des dermatophytes • Teignes du cuir chevelu • LES TEIGNES INFLAMMATOIRES OU KÉRIONS • Elles se voient à tout âge. • Chez l'adulte, elles touchent plus volontiers les poils de la barbe, de la moustache ou des sourcils. • Elles se présentent sous forme de « macaron » en relief, suppuré. • Les poils atteints sont éliminés spontanément. • Leur atteinte parasitaire est de type microïde ou mégaspore. • Elles sont en général transmises par les animaux. • Les espèces responsables sont surtout T. mentagrophytes ou T. verrucosum.

36. Identification des dermatophytes • Les onyxis • L'atteinte des ongles débute en général par la partie distale. • Contrairement aux onyxis candidosiques, il n'y a jamais de périonyxis. • On distingue 4 types d'atteintes cliniques : • Les atteintes profondes ou disséminées • mycétomes : T. rubrum ou M. canis ont été isolés de mycétomes du cuir chevelu ; • sinusite maxillaire (exceptionnelle) : M. canis ; • maladie dermatophytique : perturbations de l'immunité cellulaire. Débutant dans l'enfance par une atteinte de la peau et des ongles, la maladie se généralise en 15 à 25 ans et atteint les viscères et le système nerveux central. Les espèces responsables sont très variées ; T. violaceum et T. rubrum sont les plus fréquemment en cause.

37. Identification des dermatophytes • Epidémiologie des espèces : • anthropophiles : parasites obligatoires de l'homme, • leur transmission est interhumaine, • soit directe, soit indirecte, • Trichophyton rubrum, Microsporum audouinii, Epidermophyton floccosum. • zoophiles : parasites des animaux, • ils sont transmis accidentellement à l'homme. • Microsporum canis, Trichophyton verrucosum. • telluriques : ils vivent dans la terre • jardinage ou par l'intermédiaire d'animaux. • Microsporum gypseum. • Certaines espèces sont cosmopolites. D'autres sont localisées à des régions particulières du globe.

38. Identification des dermatophytes • L’ examen direct de la culture • Permet le diagnostic dans la majorité des cas • S’aider +++ de l’épidémiologie, de l’examen direct de départ et de la clinique ainsi que des caractères macroscopiques de la culture • Chercher les formations typiques • Chandeliers faviques • Organes pectinés • Acladium • Chlamydospores • Nombre et forme des microconidies • Nombre et forme des macroconidies • Extremite ronde ou pointue • Nombre de logettes • Spicules………

39. Identification des dermatophytes • Dans certains cas le diagnostic différentiel entre les dermatophytes est difficile • La culture sur lame • Lame ou carré • la recherche de l'uréase • T. mentâgrophytes est uréase positif et fait virer le milieu au rouge fuchsia en 3 jours. • la recherche des organes perforateurs • T. mentâgrophytes qui produit des organes perforateurs, T. rubrum, qui n'en produit pas. • l'inoculation au cobaye

40. dermatophytes

41. Conclusion • Le diagnostic mycologique suppose une collaboration étroite entre le médecin et le biologiste. • Le médecin • doit fournir un minimum de renseignements • cliniques • épidémiologiques • âge, • race, • notion de voyages antérieurs, • contacts avec des animaux etc.) • Le biologiste doit signaler le plus rapidement possible au médecin les résultats obtenus (direct +++) • Pour le biologiste : connaître et reconnaître