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基因工程

基因工程. Genentech Founders. 1973 年 Stanley Cohen 和 Herbert Boyer DNA 重组 ：不同来源的 DNA 分子通 过末端共价连接重新组合成新的 DNA 分子 pSC101 RSF1010

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Presentation Transcript

  1. 基因工程

  2. Genentech Founders • 1973年Stanley Cohen 和Herbert Boyer DNA重组：不同来源的DNA分子通 过末端共价连接重新组合成新的 DNA分子 pSC101 RSF1010 pSC109 E coli C600

  3. 基本概念： • 基因工程：genetic engineering 克隆基因并表达基因的相关产物，或定向改造细胞或生物的特性的方法及相关的技术 • 分子克隆：molecular cloning 分子克隆就是基因克隆，是在体外获得基因并进行操作的过程，其核心是 DNA 重组技术。 • 克隆：clone 由一个细胞经过无性繁殖所形成的子代群体 单一DNA重组体的无性系

  4. 第一节 工具酶 • DNA 重组技术依赖于各种工具酶的发现与使用，以及用途多样的基因工程载体的产生。 • 工具酶：切割、合成、连接、修饰

  5. 一、限制性内切酶（restriction enzyme) • 细菌产生的一种能特异性识别DNA序列并水解磷酸二酯键， • 切开DNA双链。 • 它是细菌的一种 • 防御机制。

  6. 1. 限制性内切酶的分类 • II 型限制性内切酶是分子克隆常用的工具酶。

  7. 2.限制性内切酶的命名 EcoR I 属名 种名 株系 编号 Escherichia coli R I

  8. 3. II型限制性内切酶的作用特点 • 识别序列：一般是 4－8 碱基对，具有回文结构，错位对称切割。 • Rsa I EcoR I Not I • GTAC GAATTC GCGGCCGC • CATG CTTAAG CGCCGGCG • 一般识别 6 碱基回文序列的限制酶是最常用的。平均 46＝4096 bp 就有一个切点。 • 特殊识别序列： BstE II EcoR II • GGTNACC CC GG A T

  9. 作用特点 • 切割方式： 粘端：5，突出 3，突出 平端 • 相同的粘端能够识别并结合。

  10. 同工异源酶、同尾酶 • 同工异源酶：来源不同，识别并切割相同序 列。 • BamH I 和BstI－－G↓GATCC • Xho I和 PaeR7 －－ C↓TCGAG • 同尾酶：识别序列不同，产生相同的粘性末端酶。 BamH ISau3A I GGATCCNGATCN CCTAGG NCTAGN

  11. 4. 限制性内切酶的应用 • 用途广泛，是基因工程技术的必备工具。 • DNA 分子的剪切操作。 • 绘制基因组的物理图谱。 • DNA 突变的检测(RFLP)。 • 限制性内切酶的反应条件： • Mg2+ • pH，一般为中性条件。 • 离子强度，不同酶需不同浓度的Na＋或K＋。

  12. λ噬菌体DNA的限制酶酶解

  13. 二、修饰酶 • （1) DNA聚合酶 I：MW 109KD • 5,→3, 聚合 • 具有 3,→5, 外切 活性。 • 5,→3, 外切 • 用途：缺口平移，cDNA第二链合成， • DNA 3,突出端标记。 DNA pol I 5 3

  14. Klenow • Klenow 片段（76KD)： • 具有 5,→3, 聚合与 • 3,→5, 外切活性。 • 补齐DNA3’端； • 标记3’末端 • 合成cDNA第二链 • DNA序列分析 • Taq DNA聚合酶： • 自嗜热水生菌(Thermus aquaticus)中克隆。 • 没有校读活性，72℃为最适反应温度。 • 应用于 PCR。 蛋白酶

  15. 2、逆转录酶 • Reverse transcriptase，以 RNA 为模板，指导合成 DNA 的酶。主要用于 cDNA 合成。 • 种类：AMV和MMLV • 三种活性：逆转录 • RNase H • DNA pol • 目前常用的逆转录酶 RNase H 均缺失。 • 逆转录酶需要引物。

  16. 3、DNA连接酶 • 连接DNA的单链切口，粘端与平端。 • 匹配粘端才能连接。 • T4 噬菌体 DNA 连接酶： • 需ATP，可连接 RNA， • 是基因工程常用的连接酶。 • 大肠杆菌连接酶：Ecoli DNA ligase 需NAD＋，不能连接 RNA，主要用于 cDNA合成。

  17. 4、碱性磷酸酶 • 牛小肠碱性磷酸酶(CAP)： • 活性：水解 DNA 或 RNA 5,末端磷酸基团。 • 用途：防止载体回连。 • 5,末端标记。 • 酶联显色。

  18. 5、末端脱氧核苷酸转移酶 • 催化脱氧核糖核苷酸依次添加到 DNA 3,羟基端。 • 聚合反应没有特异性。 • 3,突出端时活性最强。 • 用途：末端标记； DNA末端添加同聚尾， 构建人工粘性末端。

  19. 第二节 载体(vector) • 基因克隆需要基因的载体，运载基因进入宿主细胞并进行复制。 • 载体必备的基本条件： • 复制子 • 选择性标记 • 多克隆位点 • 容量 • 表达型载体：启动子等调控元件。

  20. 以Ecoli为宿主细胞的载体 • 质粒 • λ噬菌体 • 粘粒 • M13噬菌体

  21. 一、质粒 • 细菌的染色体外遗传单位，小分子环状DNA。 • 分子量相对较小 • 具有抗药性基因 • 具有多克隆位点 • 具有自身的复制起点 • 目前用于基因克隆的质粒载体均来源于天然质粒，经人工构建而成。

  22. 质粒载体的特点与用途 • 分子量小，便于进行分离纯化和切割连接，能够直接导入细胞。 • 容量较小，质粒长度如果大于 10 kb，则导入细胞较为困难。 • 质粒是最常用的基因工程载体，可以用于基因的克隆，DNA 序列测定，基因的体外转录以及基因表达。

  23. 质粒载体的种类 • 早期载体：pBR322 • 早期最成功的载体， • 包括了载体的全部 • 基本结构。 • 但质粒分子偏大， • 限制酶切点太少。

  24. 质粒载体的种类 • pUC18 与 pUC19： • 质粒在细胞内拷贝数更高。 • 携带 lacZ 基因，可用于重组子筛选。 • 限制酶切点 • 很多，便于 • 切割与连接。 • pUC118/119： • 添加M13单 • 链噬菌体复 • 制起点。

  25. 二、λ噬菌体 • 线状双链 DNA 噬菌体，基因组长 48.5 kb。 • 两侧具有 12bp 长的天然粘性末端：COS • 具有裂解生长与溶源生长两种状态。

  26. λ噬菌体的特点 • λ噬菌体基因组较大，必需包装形成病毒颗粒后感染细胞。 • 包装要求 DNA 有 COS末端，且长度为基因组原长度的 75％-105%。 • λ噬菌体 DNA 的 40％可以被替换。最长可以插入约 23 kb 的片段。

  27. λ噬菌体的种类 • λ载体可以分为插入型与置换型： • 插入型：一个限制酶切点。 • 理论容量为：0－13.5 kb • 置换型：两个限制酶切点。 • 理论容量为：9－22.5 kb

  28. λ噬菌体的种类 • Charon 40：置换型载体，克隆 9.2－24.2 kb片段。 • EMBL 3：置换型载体，克隆片段长度：7－22 kb。 • Spi 筛选(野生型在含P2噬菌体的宿主中受限)。 • λgt 10：插入型载体，克隆 0－7.6 kb 片段。 • CI 筛选(野生型载体易进入溶源生长状态)。 • λgt 11：插入型载体，克隆 0－7.2 kb 片段。 • LacZ基因插入失活。 • λDASH：置换型载体，克隆 9－22 kb 片段。 • Spi筛选，T3 与 T7 启动子。 • λZAP：插入型载体，克隆 0－10 kb 片段。 • 带有 ColE1 复制子，可自动形成质粒。

  29. 三、粘粒（cosmid） • 由质粒与噬菌体COS末端组成，可克隆 40-45 kb片段。

  30. 粘粒的特点 • 优势： • 含有质粒的抗药性标志Ampr或Tetr • 具有cos位点，可进行体外包装 • 具有一个或多个酶切位点 • 容量更大，适用于真核基因组序列的克隆。 • 非重组粘粒小，不能体外包装，有利于筛选。 • 缺陷： 插入片段长度对扩增效率影响极大。

  31. 四、丝状噬菌体载体 • 噬菌体颗粒为丝状，具有环状单链 DNA 基因组，长度 6.5kb。包括 M13 及其高度同源 f1、fd。 • M13 只能感染具有 F 因子的雄性大肠杆菌。 • M13mp18/M13mp19： • 携带 lacZ 基因，内部具有多克隆位点，便于筛选。 • 容量有限且易丢失，一般不用作常规克隆，而是用于生成 DNA 单链进行测序。

  32. 其它载体 YAC：容量0.5-2MB

  33. BAC：容量0.1-0.4MB

  34. 表达载体： expressing vector • 基本条件：具有克隆载体的性质 具有表达构件 • 宿主细胞：大肠杆菌、分枝杆菌、放线 菌、酵母、哺乳细胞等

  35. （一）大肠杆菌表达载体原核生物的表达调控元件（一）大肠杆菌表达载体原核生物的表达调控元件 启动子：起始转录的部 位，同时也是 转录调控部位。 SD序列：翻译起始。 终止子：转录终止。

  36. 原核生物的表达调控元件 启动子：起始转录的部 位，同时也是 转录调控部位。 SD序列：翻译起始。 终止子：转录终止。

  37. 常用原核启动子 • Tac 启动子： • Trp 与 Lac 组成的杂合启动子，含有 Trp 启动子的－35区，人工合成的 －10区，以及 Lac 启动子的操纵基因。载体需要携带LacI基因。 • 非常强的启动子，接受 IPTG 诱导，但不被葡萄糖等抑制。 • T7噬菌体启动子：高度特异的启动子，只有在具有 T7 RNA 聚合酶的宿主中才能表达。 • 在T7启动子下游添加乳糖操纵序列，则可接受 IPTG 的诱导。 • λ噬菌体pL启动子：受控于温度敏感的阻抑物（cIts857），它在低温下阻抑转录，高温则失去作用

  38. S D 序列 • 转录起始点与起始密码子间必需有 SD序列。 • SD序列与起始密码子之间的距离对转录活性至关重要。

  39. 转录终止序列 • 长度：几十bp至800bp • 特点：对RNA聚合酶有强终止作用的终止子有一段富含A/T和一段富含G/C区域，G/C富含区具有回文结构

  40. （二）哺乳动物表达载体 • 真核细胞载体几乎都是表达载体。 • 首先具备不可缺少的原核序列： ori、抗性基因和MCS • 保证真核表达的必要元件： • 启动子与增强子：一般利用病毒的强启动子与 • 增强子。 • 加尾信号：AAUAAA序列。 • 剪接信号：插入片段自身提供，一般不需要。 • 选择标记：胸苷激酶基因 (tk) 与新霉素抗性 • 基因 (neor)。

  41. 第三节 重组DNA技术的基本过程

  42. 一、目的基因的制备 • 基因克隆的工具酶与载体系统目前已经非常成熟，目的基因的获取是最困难的工作。 • 依据基因位置的克隆：限制性内切酶酶切。 • 定位克隆。 • 依据基因序列的克隆：PCR 扩增。 人工合成基因。 • 自文库筛选同源性基因。 • 依据基因功能的克隆：免疫筛选。 • 利用蛋白功能直接筛选。

  43. （一）制备基因组DNA • 基因文库（genomic library）利用限制性内切酶对基因组进行酶解后，将片段随机构建于质粒、λ载体或 YAC。克隆DNA片段的总和应为整个基因组的DNA序列。 • 也称鸟枪法(shotgun)。 • 适用与克隆原核基因或进行基因组全长序列测定。

  44. （二）制备cDNA • cDNA文库：将一个特定来源的cDNA与载体进行连接，所得到的所有重组DNA分子的总和。 • cDNA：以 mRNA 为模板，反转录酶作用下生成的互补 DNA。 • oligo(dT) 为引物合成第一链，RNA 酶解片为引物合成第二链。 • 5，端是缺失的。

  45. 全长 cDNA 合成 • SMART： Switch mechanism at RNA terminal

  46. cDNA 文库特点与作用 • cDNA 文库就是真核细胞表达序列文库，是筛选真核细胞基因的基本途径。 • cDNA 序列没有内含子，可以在原核生物中表达。 • 不同组织来源的 cDNA 文库组成不同，因此具有组织来源的局限性。 • 不同基因的丰度差异大，低丰度基因不易筛选。

  47. （三）制备表达的基因片段 直接用限制酶切取 • 适合：物理图谱确定，背景资料清楚的原核生物、细菌及动物DNA病毒等基因组 对于真核生物基因，先筛选文库然后酶切得到。

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