Imunológia –praktické cvičenie č. 1.

1. Imunológia –praktické cvičenie č. 1. bunky imunitného systému

2. Použité zdroje • Buc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5 • http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficientne_stavy.pdf • Bunky imunitného systému dostupné na https.ics.upjs.sk~paulikovaimufilestahajimu2.pdf

3. hematopoéza • Bunky imunitného systému • -rôzne dlhý čas života • - úbytok je dopĺňaný hematopoézou • Hematopoéza • - formovanie a vývoj červených a bielych krviniek z kmeňovej pluripotentnej bunky • -u dospelého jedinca prebieha najmä v kostnej dreni (medulárne) • -základom hematopoézy je • pluripotentná kmeňová bunka, ktorá sa diferencuje na lymfoidné a myeloidné kmeňové bunky

4. Hematopoéza • -z kmeňových buniek vznikajú progenitorové bunky, ktoré sú nasmerované k diferenciácii na základné typy krvných buniek: • Erytrocyty • lymfocyty • trombocyty • monocyty • Granulocyty • -Hematopoéza je regulovaná najmä cytokínmi: • IL-3 (multilineage-CSF) • GM-CSF • M-CSF • G-CSF • erytropoetín • IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9

8. klasifikácia • prítomnosť membránových znakov(rozpoznávacie glykoproteíny) na povrchu bunky • CD (na všetkých leukocytoch) • expresia receptorov na rozpoznávanie antigénov (len na T a B –Ly) • MHC antigény

9. Systém bunkových znakov CD –znak (marker) • CD = cluster of differentiation • CD znak – jedinečná molekula alebo komplex molekúl,ktoré bunka exprimuje • Tieto molekuly pomáhajú diferencovať typ (subtyp) bunky, jej maturačné štádium, stupeň aktivácie... • Názov pozostáva z písmen CD a číslic (napr.:CD3,CD8,...)

10. CD znaky • CD3 –len naT –Ly (na všetkých subtypoch) • CD4 –TH • CD8 –TC • CD19 –len naB –Ly • CD64 –monocyty • CD66 –PMNLs • CD68 –makrofágy • CD16 –NK bunky • CD40 –dendritické bunky • CD33 –všetkymyeloidnébb.

11. Polymorfonukleárne lekocytyPMNL • Viaclaločnaté jadro a granuly v cytoplazme • Na základe rozdielneho farbenia granúl rozlišujeme 3 typy granulocytov: • Neutrofily–nefarbia sa ani bázickymi ani kyslými farbivami • Eozinofily–farbia sa kyslými farbivami na červeno • Bazofily–farbia sa bázickými farbivami na tmavomodro

14. neutrofily • 60% z leukocytov (4,3–11x109/1lkrvi) • Veľkosť: 15μm • Nezrelé –tyčka (tvar jadra) • Zrelé – segmentované jadro Vcytoplazme: • -granuly s baktericídnymi látkami –primárne (azúrofilné) obsahujú hydrolázy, myeloperoxidázu • Sekundárne – obsahujú laktoferín, lyzozým, alkalickú fosfatázu, kolagenázu... • Glykogén –zdroj glukózy pri anaeróbnej glykolýze → PMNL môžu zostať v poškodenom tkanive s nízkym obsahom O2, napr. vmiestebakteriálnejinfekcie Bunková membrána: • Receptory (Fc R pre IgG, CR), adhezívne molekuly (integríny, selektíny

15. neutrofily FUNKCIA: • Základné bunky 1. obrannej línie proti patogénom, cudzorodým bb. • Profesionálne fagocyty • enzýmy sekundárnych granúl rozkladajú antigén (Ag) • Dôležitá úloha v zápalovom procese (rýchla mobilizácia, uvoľnenie mediátorov zápalu)

17. eozinofily • 4% zo všetkých PMNL • 18 μm V cytoplazme: • okolo 200 granúl – hlavný bázický proteín (MBP), kyslá fosfatáza, arylsulfatáza, eozinofilnáperoxidáza, kationický proteín eozinofilu • -MBP pôsobí toxicky na parazity a nádorové bb., väzbou na bazofilnébb. z nich uvoľňuje histamín Na membráne: - receptory pre IgE a zložky komplementu - dôležitá úloha pri alergických reakciách FUNKCIA: • proti parazitárnym infekciám (hlavne proti helmintom v črevnom trakte) • proti nádorovým bunkám • Účasť pri zápalových reakciách ( sú aktivované lymfocytmi) • alergické reakcie • schopnosť fagocytózy

19. bazofily • <0.2% z Leu • Morfologicky sa podobajú tkanivovým mastocytom, • ochrana mukóznych povrchov tela Cytoplazma: • Granuly – veľké množstvo zápalových mediátorov (heparín,histamín...); • Neobsahujú peroxidázu Membrána: • Receptory FcRε(pre IgE) FUNKCIA: • -alergické reakcie • -nefagocytujú

21. mastocyty • Tkanivové bunky • 30μm • Mononukleárne bunky s metachromatickyzafarbenýmigranulami • Relatívne maléjadro - v spojivovom tkanive, hlavne pri krvných, lymfatických cievach a pri periférnych nervoch - blízko epitelových povrchov(dýchací, tráviaci systém a koža) Cytoplazma: • granuly : zápalové mediátory (heparín,histamín...), neobsahujú peroxidázu Membrána: • -receptory FcRε(preIgE) Funkcia : hlavné bunky pri alergických reakciách

22. Mastocyty

23. monocyty • 6-8% – mononukleárnebb. • Okrúhly tvar, veľa cytoplazmy, veľké, excentricky uložené jadro Cytoplazma : vakuolizovaná, farbí sa slabo bazofilne (sivo-fialovo) . • (Monocytóza so zvýšením množstva leukocytov je aj priaznivým symptómom pri septických procesoch a infekčných ochoreniach) FUNKCIA: • Profesionálne fagocyty • APC • *Zrelé monocyty putujú z kostnej drene do krvi, kde zostávajú cca15-30 hodín Potom adherujú na cievny endotel a opúšťajú krvné riečištediapedézou, premiestňujú sa do tkanív, kde sa premieňajú na makrofágy.

24. Monocyty

25. Antigén prezentujúce bunky = APC(AntigenPresentingCells) • DENDRITICKÉ BUNKY (DC) • MAKROFÁGY • B -LYMFOCYTY • FUNKCIA: • vychytanie Ag • spracovanie Ag • prezentácia Agpeptidov špecifickým T -Ly

27. makrofágy • Determinačné povrchové znaky: CD54, CD68, MHC, Fc receptory, C receptory Monocyt z krvi →prechod do tkaniva →premena na makrofág • mononukleárne fagocyty • dĺžka života 75 dní • antigén prezentujúce bb. = APC • Tkanivové makrofágy –1. obranná línia hostiteľa • VÝSKYT:- • Alveolárne v pľúcach • Kupfferove bb. v pečeni • histiocyty v spojivovom tkanive • mikroglia v CNS • osteoklasty v kostiach • peritoneálne a pleurálne v seróznych dutinách • Intravaskulárne v endoteli kapilár

28. makrofágy • FUNKCIE: • Schopnosť rozpoznať, vychytať, spracovať a prezentovať antigén • fagocytóza • Expresia MHC molekúl II. triedy • Produkcia imunoregulačných látok • Schopnosť odovzdávať nešpecifické stimulačné signály • Produkcia reaktívnych molekúl

29. Dendritické bunky DC • v nelymfatických periférnych tkanivách • Langerhansove bb.(koža, dlaždicový epitel ústnej dutiny, pažeráku a pošvy) • intersticiálne DC (srdce, obličky) • v cirkulácii : DC v periférnej krvi (0,4 %) • závojnaté bb.(aferentné lymfatické cievy) • v sekundárnych lymfatických tkanivách : vmedzerené DC • v medule týmusu týmusové DC

31. Dendritické bunky (DC) • FUNKCIA: • najvýkonnejšie APC • schopnosť aktivovať naivné T –Ly • fagocytóza (častice a mikróby) • makropinocytóza (solubilnéAg) • Závojnatá DC + Ly

32. lymfocyty • Ly : malý, stredný, veľký • Malý 8-12μm. Jadro: - okrúhle alebo oválne tvorené masami chromatínu Cytoplazma: • úzky lem, svetlomodrá • T–lymfocyty (65–75%) • B–lymfocyty(20–30%)

34. lymfocyty

35. lymfocyty • Lymfocyty - vyvíjajú sa z hematopoetickej kmeňovej bunky v kostnej dreni • T lymfocyty migrujú do thymusu, • B lymfocyty zostávajú v kostnej dreni • B lymfocyty - zodpovedné za humorálnu časť (Ab) • T lymfocyty - celulárna časť imunitnej reakcie

36. B-lymfocyty: produkujú a secernujú Ab do telesných tekutín, zastupujú preto humorálnu imunitu • T-lymfocyty: reagujú priamo s cieľovými bunkami (napr. ktoré boli napadnuté vírusmi alebo tumorózne zvrhnuté), preto reprezentujú bunkovú imunitu • Obidve populácie majú na svojom povrchu odlišné glykoproteíny, ktoré môžu byť dokázané pomocou monoklonálnych protilátok

37. T lymfocyty TH(helpery) CD4: - Regulujú humorálne aj bunkami sprostredkované imunitné odpovede – pomáhajú TS(supresory) CD8 : • Môžu potláčať imunitnú odpoveď TC(cytotoxické) CD8: • Efektorovébb. S cytolytickým účinkom • TDH(delayed-typehypersensitivityreaction)- • sprostredkujúoneskorenýtyphypersenzitivity • TH a TS majú odlišné vlastnéantigény, podľa ktorých sa identifikujú

38. T lymfocyty • Dozrievanie v týmuse je sprevádzané identifikáciou provrchových označení CD (cluster of differentiation – diferenciačných antigénov) • CD3- prenášač signálu z antigénneho receptoru do vnútra bb, vedie k aktivácii b • CD4, CD8 prítomné pôvodne u spolu všetkých ly, umožňujú rozdeliť T-lymf. • CD4 - prítomný u T helper bb, komunikuje s molekulami HLA II • CD8 - prítomný u cytotoxických buniek, komunikuje s molekulami HLA I

40. Špecifická imunita sprostredkovanábunkami • T bunky - po stimuláciisastávajú efektorovými bunkami (priamonapádajú a eliminujúbbnapadnutévírusmi alebotumoróznezmenené) - riadiaspoluprácurôznychimunitnýchbb (syntetizujú molekuly, ktorépomáhajúinýmbunkámzničiťpatogéna)

41. B lymfocyty • B-bb dozrievajú v prostredí kostnej drene • Zrelé B-lymf nesú na svojom povrchu molekuly imunoglobulínov, ktoré slúžia ako špecifický receptor pre antigén. • V prítomnosti Ag (týmusindependentnéAg) alebo aj v spolupráci s T-lymf (týmusdependentnéAg) sa menia B-lymf na plazmatické bunky, ktoré produkujú veľké množstvo špecifických Ab

42. Plazmatické bunky

43. NK bunky • CD16, CD56,CD57 5–15% , slezina • Nulové bb.=non–B,non–T • Majú Fc receptory • Bunková zložka vrodenej imunity Funkcie: -lýza nádorových a vírusom infikovaných bb. (nešpecifická cytotoxicita bez predchádzajúcej senzibilizácie) - produkcia cytokínov zapájajúcich sa do regulácie iných procesov - rozpoznávajú cieľové bb. bez MHC restrikcie - IL-2; IFN zvyšujú proliferáciu a cytotoxickú aktivitu NK cytopl. Granuly obsahujú perforín, serínovúesterázu

44. Izolácia mononukleových bb • Z periférnej krvi • Za fyziolpodm. : z 1 ml krvi....1-2x 106mononukl. bb.(lymfocyty a monocyty v pomere 80% : 10%) CIEĽ : oddelenie ery a granulocytov METÓDA: diskontinuálna gradientovácentrifugácia POSTUP: krv +heparín (konc. 10j./1 ml krvi) -premiešať + fyziol.roztok (1:1) - do skúmavky s 5 ml zriedenej krvi navrstviť 2,5 ml separačného roztoku (verografín) - 20 min. centrifugácia

45. Izolácia mononukleových bb • VÝSLEDOK : • po centrifugácii sa nad separačným roztokom utvorí belavý prstenec mononukleových bb., ktoré odsajeme pipetou • Získané bb. centrifugujeme • Sediment 2x premyjeme vo fyziolog. roztoku • bb. spočítame v Bürkerovej komôrke (1x106 )

46. Separácia T aBlymf. Na základe tvorby roziet • T a B lymf. : rôzne membránové receptory pre väzbu s ery iných živočíšnych druhov • T lymf. : receptor pre baranie ery – tvorba E-roziet • B lymf. : receptor pre myšie ery – tvorba M-roziet • Ery sa opracúvajú chemicky (neuraminidázou) – pevnejšia väzba s lymf.

47. Separácia T aBlymf. Na základe tvorby roziet • POSTUP: • Suspenzia mononukleovýchbb. + premyté a resuspendované baranie ery (1:1), centrifugácia • Inkubácia 30 min. pri 4̊ C, navrstvenie separačného roztoku (verografín), centrifugácia • CIEĽ : • nad separač. roztokom ostanú nerozetujúcebb.(odsatie) • Rozetujúcebb. Sedimentujú na dno skúmavky • VÝSLEDOK: • Získanie suspenzie lymfocytov (T lymf.- E-rozety) (95% čistota)

48. Rozetové testy • Aktívne rozety – vyššia avidita receptorov pre baranie ery (aj pri ich malom počte) • Celkové rozety – po 18 – 24 hod inkubácii pri nadbytku ery. • Aktívne rozety lepšie odrážajú imunitný stav pacienta

49. Rozetové testy • POSTUP : - 5ml krvi do heparínu izolácia lymfocytov • Pridať suspenziu ovčích ery ( pre aktívne rozety v c 0,2%, pre celkové rozety 0,1%) • Pri stanovení celkových roziet – na 24 hod do ľadu CIEĽ : • počítanie lymfocytov a roziet v Bürkerovej komôrke VÝSLEDOK : • Rozeta : lymf. + najmenej 3 ery • Aktívne r. : 25 +/- 10% • Celkové r. : 65 +/- 10%

50. Pod mikroskopom počítame počiet roziet a čistých lymfocytov do 100, počet roziet udáva % počet B alebo T lymfocytov Lymfocyt rozety Morč.ery