In the name of God

1. In the name of God

2. دکتر فرشته شاهچراغی دانشیار-عضو هیأت علمی انستیتو پاستور ایران رییس بخش میکروب شناسی آزمایشگاه کشوری سیاه سرفه

3. What is Pertussis (Whooping cough) • Highly contagious respiratory infection caused by Bordetella pertussis • Outbreaks first described in 16th century • Pertussis is a world wide disease • Bordetella pertussis is an exclusively human pathogen • Dramatic for neonates and infants but can be very severe for children and adults.

4. Pertussis remains one of the top 10 causes of death in children under 1 years old worldwide • 10 million cases worldwide • 400,000 deaths worldwide 90% in developing countries and mostly in infants

5. Pertussis—as a re-emerging infection Case fatality rates • Developing countries 1 - 2% (important problem) • Developed countries 0.04% (re-emerging problem france, USA, Sweden, Japan, England, Netherland, Canada

6. Pertussis incidence in US

7. Resurgence of Pertussis • Duration of protection and waning immunity following infection and vaccination • Incomplete protection from vaccination • Infection source for infants • Infection source for adolescents • Strain polymorphism • Increased diagnosis and reporting.

9. Cause of pertussis? • Gram negative coccobacillus (Bordetella pertussis) • Isolated in 1906 • Obligate aerobe • Non-motile • optimal growth at 35-37 °С with humidity • Fastidious • No growth on routine blood agar • Catalse and Oxidase positive • Slow growing, requires 3-10 days of culture for identification • Media: • Bordet-Gengou • Regan-lowe • Colony: • smooth, tiny, glistening • Appearance = “mercury-drop” or “pearl”

10. Bordetella spp. • B.Pertussis, Bordet and Gengou(1900) • B. parapertussis, Bradford and Slavin (1937) • B.bronchiseptica, Ferry:1910 • B. holmesii • B. avium • B. Hinzii • B. Trematum • B.petrii

11. B. pertussis virulence factors • Adhesions • Toxines

12. Pertussis Vaccine • 1st Pertussis vaccine- whole cell (1940s) • Acellular vaccine (PT, FHA, PRN, FIM) • Combination vaccines

13. Pathogenesis Attack to lymphocytes of immune system Inflammation in respiratory tract

14. 75% transmitted from close contacts Other 25% Mom 32% 25% Others Grandparent 8% Dad 15% Sibling 20% 47% Mom or Dad 8% grandparents 20% sibling

16. Prevention • Vaccination of children • Treatment by azithromycine and erythromycine 50 mg/kg in 10 days • Sampling of other persons contact to patients • Daily control of the family of patients

17. What affects the clinical presentation of pertussis? Age Adults and older children are less likely to have typical symptoms—eg, simple cough Very young infants might present atypically—eg, with apnoea alone—and not cough Previous infection Subsequent infections are milder Previous vaccination Time since previous vaccination or infection Longer time, increased severity of infection Co-infection

18. Pertussis in adults and adolescents • Symptoms ………………… less typical • Duration of cough……….. 36-48 days • Accompanied……………. Other symptoms • pool of frequently undiagnosed pertussis cases ……….. Reservoir in very young patients

19. Laboratory diagnosis

20. اهمیت جمع آوری سویه های بالینی • بررسی ویژگی آنتی ژنی سویه های جمع آوری شده و مقایسه آن با سویه های قبلی جهت مطالعه جهش ژنتیکی در خصوص تهیه واکسن • بررسی گردش سویه ها در جامعه و بین بیماران و نحوه انتشار این سویه ها • تهیه مخزنی از سویه های Bordetella pertussis جمع آوری شده از نمونه های بالینی طی سالهای متمادی • بررسی روند بهبود در تشخیص بیماری، نمونه گیری، ارسال نمونه و تشخیص آزمایشگاهی باکتری در طی زمان • بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی سویه ها و تغییرات مقاومت در طول زمان

21. اهمیت نمونه برداری • کیفیت نمونه بستگی دارد به: • جدی گرفتن از سوی پرسنل • استفاده از دستورالعملهای مناسب و دقیق • در استفاده از مواد و محیطهای ترانسپورت • رعایت زمان مناسب در انتقال نمونه به آزمایشگاه • Specimens of bacterial culture must not be stored for more than 24 hours prior to sending laboratory.

22. نمونه های بالینی مشکوک به سیاه سرفه ارسال شده به انستیتو پاستور تهران

23. مراحل تشخيص آزمايشگاهي بيماري ارسال نمونه ها به مراکز تشخیصی (پاستور) نمونه گيري از بیمار توسط پزشک تشخيص آزمايشگاهي كشت سرولوژي PCR ایمونوفلورسنت

24. مقدمات نمونه گيري از بیمار • نمونه گيري از طريق پزشك مربوطه صورت مي گيرد • آماده كردن بيمار با توضيح در خصوص نمونه گيري • كامل كردن پرسش نامه • آماده كردن دستكش و ماسک و دو محیط ترانسپورتو دو عدد سواب داكرون(از سواب پنبه ای نمی توان استفاده کرد) • محيط ترانسپورت رگان- لوحاوی سفالکسین (به صورت در بسته تا دو ماه در یخچال می توان نگه داشت)

26. نمونه گيري از بیمار از کجا باید انجام شود؟ • نازوفارنکس • نازال سواب آسپیره

27. سواب را به انتهايي ترين بخش بيني برده و چند لحظه نگه مي داريم تا ترشحات به آن جذب شود و بلافاصله به محيط ترانسپورت انتقال داده مي شود. • در مورد نوزاداندر صورت عدم موفقیت در نمونه گیری از نازوفارنکس یا نازال پليت حاوي محيط كشت (برده- ژانگو) را 3 بار جلو دهان كودك در هنگام سرفه شديد نگه مي داريم. (cough plate) • اين محيط ابتدا بايد 48 ساعت در دماي C°35 انكوبه شده سپس به آزمايشگاه ارسال گردد. نحوه نمونه گيري از بیمار

28. شرايط نگهداري نمونه گرفته شده از بيمار • در صورتی که ارسال نمونه ها بلافاصله پس از نمونه گیری انجام شود (فاصله زمانی 4 ساعتارسال به آزمایشگاه) نمونه هاي جمع آوري شده را می توان در دمای محیط نگهداریو در داخل ظرف درب دار حاوی پنبه نم دار انتقال داد. • اگر امکان ارسال نمونه ها به آزمایشگاه بلافاصله پس از نمونه گیری فراهم نباشد، فرد مسئول نمونه گیری می بایستی نمونه های جمع آوری شده در محیط ترانسپورت را ابتدا 2 روز در انکوباتور در دمای C˚ 35 انکوبه کرده و پس از انکوباسیون نمونه ها را می توان در دمای اتاق حداكثر طي3 روز (72 ساعت) داخل ظرف درب دار حاوی پنبه نم دار به آزمایشگاه ارسال کند. • اگر پیش بینی می شود که ارسال نمونه ها به آزمایشگاه بیش از 72ساعت طول می کشد، جهت انتقال نمونه فرد مسئول ابتدا باید نمونه های جمع آوری شده در محیط ترانسپورت را به مدت 2 روز در دمای C˚ 35 انکوبه کرده و سپس با رعایت زنجیره سردبه آزمایشگاه انتقال دهد. در این صورت نمونه ها تا 8 روز قابلیت نگهداری خواهند داشت.

29. كشت • روش استاندارد طلايي در ميان روشهاي آزمايشگاهي است • كشت نمونه هاي ارسالي بر روي محيط برده ژانگو و رگان لو(با سفالكسين و بدون سفالكسين) • انكوباسيون در °C37-35 و كنترل كشت باكتري تا 10 روز در شرايط مناسب همراه با رطوبت • در صورت رشد باكتري بر روي محيط، تهيه اسمير از كلني هاي مشكوك و رنگ آميزي گرم • در صورت مشاهده كوكوباسيلهاي گرم منفي: • انجام تستهاي تشخيصي اكسيداز (+) و حركت (-) و API • انجام تست اسلايد آگلوتيناسيون با استفاده از • آنتي سرمهاي پلي كلونال براي تاييد باكتري بوردتلا پرتوسيس و پارا پرتوسيس

30. اولين محيط براي رشد باكتري بوردتلا پرتوسيس حاوی سفالکسین و بدون سفالکسین شامل: عصاره سیب زمینی، 1% گلیسرول و 15% خون دفيبرينه گوسفندي كلني هاي كوچك، براق و مرواريد مانند محيط برده ‍ژانگو

31. محيط رگان لو (رگان لو شاركل آگار) محيط مناسب ترانسپورت براي گونه هاي بوردتلا حاوي سفالكسين شامل: عصاره گوشت، كازئين هضم شده با آنزيمهاي پانكراتيك، نشاسته، ذغال فعال، نياسين و 10% خون دفيبرينه حیوانی

32. چه مواد و عناصري باعث تقويت و یا مهار رشد باكتري می شوند؟ مهار كننده هاي رشد تقويت كننده هاي رشد • اسيدهاي چرب Fatty acides • يونهاي فلزي Metal ions • سولفيدها Sulfides • پراكسيدها Peroxides • میزان زیاد دی اکسید کربن CO2 • نشاسته Starch • ذغال فعال Charcoal • سرم آلبومين Serum albumin • سايكلودكسترين Cyclodextrin

33. سرولوژی • سرولوژي عبارت است از تعيين تيتر آنتي بادي (IgG and IgA) ايجاد شده بر عليه آنتی ژنهای توکسین بوردتلا پرتوسيس و FHA(Filamentous hemagglutinin) در سرم خون فرد بيمار • اين تست بيانگر حضور آنتي بادي در خون چه در اثر ابتلا به بيماري و چه در اثر واكسيناسيون است (بنابراين هم در افراد مبتلا و هم در افراد واكسينه نتيجه مثبت خواهد داشت) • براي افراد بالاي 11 سال صورت مي گيرد و در صورت منفي بودن كشت و PCR پيشنهاد مي شود

34. به دليل توليد آنتي بادي در فرد واكسينه جهت بررسی افزایش میزان IgG , IgAدر اثر ابتلا به بیماری، در تست سرولوژی به دو نمونه سرم نیاز است. • بهترین تست سرولوژی مربوط به تیتر آنتی بادی IgG علیه توکسین پرتوسیس (PT) است که ویژه بوردتلا پرتوسیس بوده بیانگر ایجاد بیماری حاد در فرد مبتلا می باشد. (EU/ml125-100 ) • در 3-2 هفته زمان سرفه کردن بیمار استفاده از هر دو روش سرولوژی و PCR پیشنهاد می شود.

35. آنتي بادي فلورسنت مستقيم(Direct Fluorescent Antibody) DFA معايب • حساسيت پايين (78-18%) • نياز به تعداد زياد باكتري (>104 CFU/ml) • مناسب در مراحل اوليه بيماري • نياز به مهارت و تجربه در استفاده از ميكروسكوپ • آنتي بيوتيك درماني بر اتصال آنتي باديها ي فلورسنت • بر ديواره سلولي باكتري موثر است • اختصاصيت پايين ( 44-7%) مثبت كاذب مزايا سريعتر از كشت

36. Real-Time PCR عبارت است از تكثير ناحيه بسيار اختصاصي از ژنوم باكتري با استفاده از پرایمر و پروب اختصاصی

38. مزایای real-time PCR نسبت به کشت • بهترين و دقیقترین تست تشخيصي • زمان كوتاه مورد نیاز جهت ارائه نتایج • حساسيت بالا (<= (1CFU/ 5 µl sample) • اختصاصيت بالا • عدم نياز به باكتري زنده (مشكلات ناشي از نمونه گيري و طريقه انتقال نمونه را ندارد)

39. معايب Real Time PCR • نیاز به آماده سازی DNA باکتری • نياز به وسايل و تجهيزات دقيق • هزينه بسيار بيشتر از روش كشت و DFA • عدم استاندارد سازي اين روش • بازدارنده هاي PCR • واكنش متقاطع با گونه هاي ديگر باكتري مانند • B. bronchiseptica, B. holmesii, در صورت استفاده از IS481 استفاده از روش ملکولی جایگزین که هزینه کمتری داشته و امکان استفاده از آن در سراسر کشورفراهم باشد

40. نتایج

41. وضعیت موارد ارسالی مشکوک به سياه سرفه به انستیتو پاستور ایران طی سالهای1386-1391

43. موارد کشت مثبت سال 1392

45. موارد مثبت سیاه سرفه از نظر گروه های سنی بیماران (مجموع سال 1390 و 1391)

46. اشكالات معمول در موارد ارسالي

47. Thank you