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Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos. Canales iónicos. Luciano Moffatt INQUIMAE. 16 de noviembre 2004. Qué son los canales iónicos? Cuáles son sus roles fisiológicos? Cómo se los estudia?. Que son?. Proteínas de membrana que tienen permeabilidad selectiva por ciertos iones.
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Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos Canales iónicos Luciano Moffatt INQUIMAE 16 de noviembre 2004
Qué son los canales iónicos? • Cuáles son sus roles fisiológicos? • Cómo se los estudia?
Que son? • Proteínas de membrana que tienen permeabilidad selectiva por ciertos iones. • Son multiméricas con varios dominios trans-membrana • Comprenden de: • Poro • Compuerta (gate) • Filtro (selectivity filter) • Sensor (voltage, neurotransmisor, etc) • Mecanismo de transduccion
Que no son? • Transportadores (2 gates) • Receptores metabotropicos (no ionotropicos)
Que hacen? • Son responsables de la permeabilidad selectiva de la membrana • Permiten cambios rápidos en la concentración de iones (calcio) y del potencial de membrana (transmisión de la información a distancia).
Que no hacen? • Mantener la concentracion diferencial ambos lados de la membrana, esto lo hacen las bombas
Como se los estudia • Se mide la corriente que pasa a través de ellos. Como solo se puede medir la corriente total, se deben eliminar otros canales. Dos estrategias • Se buscan células que expresen el canal de interés, los otros canales se bloquean farmacológicamente • Se usan células que expresen naturalmente pocos canales, se sobre-expresa el canal de interés. (Util para mutagénesis).
Como se los estudia • Se miden diferentes parametros: • Conductancia • Permeabilidad relativa a distintos iones • Probabilidad de apertura en distintas condiciones • Se analiza la modulación por distintos factores (potencial de membrana, concentracion de agonistas, ph, concentracion de iones, temperatura, etc) • Se analizan transitorios y situaciones de steady state
Sistemas de expresion • Se tiene el gen o genes clonados y se los expresa en algun sistema, tipicamente: • Oocytos de Xenopus: se inyecta RNA. • Celulas HEK-293: se transfecta con el plasmido con un promotor fuerte. Se usa lipofectamina.
Oocytos de Xenopus • Lupa, no microscopio • Expresion a 20C • Corrientes grandes: µA • Aplicación lenta del agonista (10ms-1s) • Voltage clamp lento
Celulas HEK 293 • Mas parecido al mamifero: expresion a 37C • Microscopio • Patch clamp: voltage clamp rapido • Uso de EGFP para detectar la eficiencia de la transfeccion • Aplicación del agonista hasta 100µs
Sistemas nativos • Cultivos primarios: modificaciones post-traduccionales, distribucion celular • Fetas de tejidos (slices): conexiones sinápticas • In vivo: patrones de actividad sinaptica
voltage clamp vs current clamp • Voltage clamp: como las propiedades del canal dependen del potencial de membrana, conviene mantenerlo constante. • Current clamp: estudiar los canales en un contexto natural
Capacidad de las membranas: 0.01pF/µm2 • Densidad de canales: 1-1000/µm2 • 1 canal-0.5ms • En voltage clamp a Vm=cte la capacidad de la membrana no influye • Se corrige la capacidad para saltos de Vm
Patch clamp • Gigaseal • Canal unico
Whole cell vs patch • Whole cell: mas fisiologico. • Isolated Patch: mas versatil (1 µm2)
Estrategia de analisis cinetico • Obtener datos de canal unico y/o de macrocorrientes en distintas condiciones de Vm, concentracion de agonista, etc • Proponer un modelo cinetico markoviano • Optimizar los parametros del modelo que minimicen la suma de los cuadrados de los residuos. • Si la prediccion no resulta buena cambiar el modelo cinetico.
Modelos cineticos • Ver apunte de Sigworth
Resumen • Mediante los modelos cineticos se puede describir y predecir cuantitativamente el comportamiento de un canal en condiciones arbitrarias de los factores que definen su comportamiento (Vm, concentracion, etc) • El paso siguiente hacia arriba es construir una celula virtual donde se puede predecir la interaccion entre distintos canales • Para abajo se puede tratar de determinar la base estructural de las diferentes constantes cineticas obtenidas.