Canales iónicos

1. Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos Canales iónicos Luciano Moffatt INQUIMAE 16 de noviembre 2004

2. Qué son los canales iónicos? • Cuáles son sus roles fisiológicos? • Cómo se los estudia?

3. Que son? • Proteínas de membrana que tienen permeabilidad selectiva por ciertos iones. • Son multiméricas con varios dominios trans-membrana • Comprenden de: • Poro • Compuerta (gate) • Filtro (selectivity filter) • Sensor (voltage, neurotransmisor, etc) • Mecanismo de transduccion

6. Que no son? • Transportadores (2 gates) • Receptores metabotropicos (no ionotropicos)

7. Bomba sodio

8. Ionotropico vs metabotropico

9. Que hacen? • Son responsables de la permeabilidad selectiva de la membrana • Permiten cambios rápidos en la concentración de iones (calcio) y del potencial de membrana (transmisión de la información a distancia).

10. Que no hacen? • Mantener la concentracion diferencial ambos lados de la membrana, esto lo hacen las bombas

11. Como se los estudia • Se mide la corriente que pasa a través de ellos. Como solo se puede medir la corriente total, se deben eliminar otros canales. Dos estrategias • Se buscan células que expresen el canal de interés, los otros canales se bloquean farmacológicamente • Se usan células que expresen naturalmente pocos canales, se sobre-expresa el canal de interés. (Util para mutagénesis).

12. Como se los estudia • Se miden diferentes parametros: • Conductancia • Permeabilidad relativa a distintos iones • Probabilidad de apertura en distintas condiciones • Se analiza la modulación por distintos factores (potencial de membrana, concentracion de agonistas, ph, concentracion de iones, temperatura, etc) • Se analizan transitorios y situaciones de steady state

13. Sistemas de expresion • Se tiene el gen o genes clonados y se los expresa en algun sistema, tipicamente: • Oocytos de Xenopus: se inyecta RNA. • Celulas HEK-293: se transfecta con el plasmido con un promotor fuerte. Se usa lipofectamina.

14. Oocytos de Xenopus • Lupa, no microscopio • Expresion a 20C • Corrientes grandes: µA • Aplicación lenta del agonista (10ms-1s) • Voltage clamp lento

15. Celulas HEK 293 • Mas parecido al mamifero: expresion a 37C • Microscopio • Patch clamp: voltage clamp rapido • Uso de EGFP para detectar la eficiencia de la transfeccion • Aplicación del agonista hasta 100µs

16. Sistemas nativos • Cultivos primarios: modificaciones post-traduccionales, distribucion celular • Fetas de tejidos (slices): conexiones sinápticas • In vivo: patrones de actividad sinaptica

17. Voltage clamp

18. voltage clamp vs current clamp • Voltage clamp: como las propiedades del canal dependen del potencial de membrana, conviene mantenerlo constante. • Current clamp: estudiar los canales en un contexto natural

19. Modelo RC de la membrana

20. Capacidad de las membranas: 0.01pF/µm2 • Densidad de canales: 1-1000/µm2 • 1 canal-0.5ms • En voltage clamp a Vm=cte la capacidad de la membrana no influye • Se corrige la capacidad para saltos de Vm

21. Patch clamp • Gigaseal • Canal unico

22. Whole cell vs patch • Whole cell: mas fisiologico. • Isolated Patch: mas versatil (1 µm2)

23. Canal unico

24. Equipamiento

25. Amplificador de patch

26. Ejemplo de estudio de canal unico

30. Estrategia de analisis cinetico • Obtener datos de canal unico y/o de macrocorrientes en distintas condiciones de Vm, concentracion de agonista, etc • Proponer un modelo cinetico markoviano • Optimizar los parametros del modelo que minimicen la suma de los cuadrados de los residuos. • Si la prediccion no resulta buena cambiar el modelo cinetico.

31. Modelos cineticos • Ver apunte de Sigworth

32. Ejemplo de modelo cinetico

33. Ejemplo de estudio de macrocorrientes

35. Alosterismo

38. Performance de modelos

39. Resumen • Mediante los modelos cineticos se puede describir y predecir cuantitativamente el comportamiento de un canal en condiciones arbitrarias de los factores que definen su comportamiento (Vm, concentracion, etc) • El paso siguiente hacia arriba es construir una celula virtual donde se puede predecir la interaccion entre distintos canales • Para abajo se puede tratar de determinar la base estructural de las diferentes constantes cineticas obtenidas.