560 likes | 952 Views
Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie. Dozvíte se něco o:. Speciální světelné mikroskopii Zástin a fázový kontrast Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Hoffmanův modulační kontrast Fluorescenční mikroskopie Konfokální mikroskopie.
E N D
Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie
Dozvíte se něco o: Speciální světelné mikroskopii • Zástin a fázový kontrast • Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) • Hoffmanův modulační kontrast • Fluorescenční mikroskopie • Konfokální mikroskopie Vyzkoušíte si přípravu preparátů
Datum Mikroskopická technika - Blok 2 Vzor protokolu Úloha 1 – Autofluorescenceplastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem. Foto Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Foto Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Foto Foto Foto Foto
Typy preparátů • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami
1 Koehlerovo osvětlení (ideální nastavení světla v mikroskopu) 2 • V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze čočky) - konjugované. • Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu (2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4). • Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat. • Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně osvětlen. 3 Povrch zdroje světla 4
Nastavení Koehlerova osvětlení 1 2 2 1 3 http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=fNTNZ8nWPd4
Metody zvýšení kontrastu Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku
Metody zvýšení kontrastu Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě
Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC): zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem
Metody zvýšení kontrastu Hoffmanův modulační kontrast (HMC):podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)
Imunofluorescenční barvení Giardiaintestinalis • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl roztoku s protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’
Luminiscence Chemiluminiscence luciferáza – luciferin Excitace zářením: fosforescence fluorescence
Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl
Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid
Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635
Imunofluorescence F F F F F F vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky
Imunofluorescence F F F F F F
Imunofluorescence F F F F F F HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA HA HA HA
Imunofluorescenční barvení Giardiaintestinalis • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl roztoku s protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’
Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin
Fluorochromy Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP, RFP, YFP, CFP
Mitotracker Naegleriagruberi • Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru. • Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.
Obraz je rekonstruován počítačem Zdrojem světla je laserový paprsek Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu Konfokální mikroskop
Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie imunologie – lokalizace epitopů FITC, DAPI…
Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP
Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů in situ PA-GFP, FRAP,FRET
Autofluorescence plastidů Zygnemasp. Euglenagracilis • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s immerzním olejem. Plastidy emitují červené světlo.
Mitotracker Naegleriagruberi • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker emituje červené světlo.
Imunofluorescenční barvení Giardiaintestinalis HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin