490 likes | 778 Views
Mikroskopická technika. Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Pavel Němec. Co vás tu čeká?. Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.) Speciální světelná a elektronová mikroskopie (V. Hampl a kol.) Základy obrazové analýzy (P. Němec a R. Černý)
E N D
Mikroskopická technika Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Pavel Němec
Co vás tu čeká? • Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.) • Speciální světelná a elektronová mikroskopie (V. Hampl a kol.) • Základy obrazové analýzy (P. Němec a R. Černý) • Počítání mikroskopických objektů (V. Sacherová a kol.)
Co potřebujete na zápočet? • Minimálně 75% účast na praktiku • Odevzdání protokolů vypracovaných během cvičení • Nákresy dělejte velké, • Kreslete, co vidíte v mikrokopu a ne, co je v naší prezentaci, • nestínujte, nešrafujte.
Doporučené studijní materiály • Naše webové stránky, kde jsou uvedeny prezentace k přednáškám i odkazy na literaturu: http://natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikroskopickatechnika/
Něco navíc o světelné mikroskopii Knihy a skripta: • Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 • Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy • Petr Smékal: Experimentální metody biofyziky II, Světelná a elektronová mikroskopie. Skriptum PřF Ostravské Univerzity, 1995 • Časopis Vesmír: • Mikroskopy, věda, průmysl... 1997/10, str. 576 • Mikroskopie (barevná dvojstrana uprostřed časopisu). 2004/3 • Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146 A samozřejmě internet!!!Například stránky firem vyrábějících mikroskopy
Krátký pohled do historie mikroskopování • 1590-1610 bratři Janssenové, první mikroskop • 17. -18. století A. Leeuwehoek • 1847 průmyslová výroba mikroskopů firmou Zeiss • 1911 C. Reichert, fluorescenční mikroskop s UV excit. • 1932 F. Zernick, fázový kontrast • 1955 Nomarski, diferenciální interferenční kontrast • 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop • 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop
Leeuwehoekův mikroskop Krátký pohled do historie mikroskopování
Hookův mikroskop cca 1678 Krátký pohled do historie mikroskopování
Světlo Způsoby popisu ve fyzice: Vlnový model (elektromagnetické vlnění) Kvantový model (proud fotonů) Geometrický model (světelný paprsek)
Světlo • Rychlost (c) Ve vakuu 3 x 108 m/s • Vlnová délka (l) Vzd. mezi odpovídajícími si body sinusoidy • Amplituda (A) Největší odchylka sinusoidy od nulové hodnoty • Fáze (f) Udává v jaké části sinusoidy se vlnění nachází v urč. časovém úseku • Frekvence (f) Počet kmitů za jednotku času
Odraz a lom světla úhel dopadu = úhel odrazu
Odraz a lomsvětla řidší prostředí hustší prostředí = lom ke kolmici
Odraz a lomsvětla = lom od kolmice řidší prostředí hustší prostředí
Čočka Světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku se v obrazové rovině sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu
čočka Ohnisko (F) Optická osa ohnisková rovina rovina čočky ohnisková vzdálenost Čočka
Skutečný a převrácený obraz Okulár, lupa Objektiv F Zdánlivý obraz předmět mezi F a 2xF Předmět blíže než ohnisko (F) čočky Čočka – vznik obrazu F f F
Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz zdánlivý a zvětšený obraz skutečný, převrácený a zvětšený obraz Vznik obrazu ve světelném mikroskopu
Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz Vznik obrazu ve světelném mikroskopu
Vznik obrazu ve světelném mikroskopu Fyzikální podstata vzniku obrazu v mikroskopu: Ernst Abbe (1873): poměrně složitá teorie, založená na využití Huygensova principu a interferenci transformovaných světelných vln procházejících preparátem
Zvětšení světelného mikroskopu Zvětšení objektivu x zvětšení okuláru
zvětšení numerická apertura Zvětšení světelného mikroskopu Maximální užitečné zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu
numerická apertura Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu Vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body a = 0,61 l/ n x sina l - vlnová délka n – index lomu prostředí před objektivem a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu • Rozlišovací schopnost lze zvýšit: • snížením λ použití modrého světla (modrý filtr) • zvyšováním n použití imerzního oleje
světla Hlavní vypínač Ovlavač intenzity světla
Preparát č. 1:Amoeba proteus Zvětšení:
Typy objektů • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně různé části světelného spektra, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami
Barvení preparátů Nativní Živé buňky – nutno použít vhodný fyziol. roztok (savci a ptáci 0,85%, obojživelníci 0,64%, pufrovaný fyz. roztok PBS...) možno barvit vitálně karmín – potravní vakuoly mitotracker – mitochondrie metylénová modř – odlišení živých a mrtvých bb, živé se neobarví Trvalé Musí se fixovat – proti posmrtným změnám bb a tkání při zachování barvitelnosti denaturací bílkovin se zpevní a zakonzervují bb struktury • Roztěry • Suchý r. –fixace po zaschnutí (methanol), 2D objekty • Vlhký r. – fixace za vlhka (Bouin-Holland, sublimát, aj.), 3D objekty • Celkové preparáty • Kus tkáně • Malý živočich (fix. Alkohol 70-80% či formaldehyd 4% Typy barviv: pH kyselá: eosin, světlá zeleň, kyselý fuchsin, kyselina pikrová zásaditá:metylénová modř, toluidinová modř, bazický fuchsin neutrální: Giemsa-Romanowski, různé formy stříbra objekt barvení motolice a tasemnice:borax-karmín prvoci: Giemsa-Romanowski, protargol, hematoxylin tkáně: hematoxylin-eosin
Nativní preparát:Tetrahymena pyriformiskarmín Trvalé preparáty: Tetrahymena pyriformisopálová modř Trypanosoma carassiGiemsa-Romanowski Tritrichomonas foetusGiemsa-Romanowski
Trvalé barvení:Suchý roztěrTrypanosoma carassiTritrichomonas foetuspro barveníGiemsa-Romanowski
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu
Preparát č. 5: Tetrahymena pyriformis Barvení: karmín
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski :Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski:Trypanosoma carassiTritrichomonas foetus • Fixáž methanol 3´ • Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ • Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ • Po oschnutí pozorování preparátu
Imerzní olej • Předejdeme ztrátám světla • Do objektivu dopadne větší množství paprsků • Obraz obsahuje víc detailů
Preparát č. 6:NAKRESLIT!!!Tetrahymena pyriformis Barvení: opálová modř Zvětšení: cytostom řasinkové rýhy vakuola
Preparát č. 7: NAKRESLIT!!!Trypanosoma carassi Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: jádro kinetoplast undulující membrána
přední bičíky pelta jádro axostyl undulující membrána kosta volný zadní bičík Preparát č. 8:NAKRESLIT!!!Tritrichomonas foetus Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: