V4 – Analyse von Genomsequenzen

V4 – Analyse von Genomsequenzen - Gene identifizieren z.B. Hidden Markov Modelle - Transkriptionsfaktorbindestellen identifizieren Position Specific Scoring Matrices (PSSM) - finde Repeat-Sequenzen Suche nach bekannten Repeat-Motiven - Genom-Assemblierung finde identische k-Tupel - Genom-Alignment Suche nach MUMs (maximal unique matches) Softwarewerkzeuge

Einleitung – Gene identifizieren Die einfachste Methode, DNA Sequenzen zu finden, die für Proteine kodieren, ist nach open reading frames (ORFs) zu suchen. In jeder Sequenz gibt es 6 mögliche open reading frames:: 3 ORFs starten an den Positionen 1, 2, und 3 und gehen in die 5‘ 3‘ Richtung, 3 ORFs starten an den Positionen 1, 2, und 3 und gehen in die 5‘ 3‘ Richtung des komplementären Strangs. In prokaryotischen Genomen werden Protein-kodierende DNA-Sequenzen gewöhnlich in mRNA transkribiert und die mRNA wird ohne wesentliche Änderungen direkt in einen Aminosäurestrang übersetzt. Daher ist der längste ORF von dem ersten verfügbaren Met codon (AUG) auf der mRNA bis zu dem nächsten Stopcodon in demselben offenen Leserahmen, gewöhnlich eine gute Vorhersage für die Protein-kodierende Region. Softwarewerkzeuge

Methode Erhalte neue genomische DNA-Sequenz Übersetze sie in allen 6 Leserahmen und vergleiche sie mit der Datenbank für Protein- sequenzen. Führe Suche in EST- Datenbank oder cDNA- Datenbank desselben Organismus nach ähnlichen Sequenzen durch, falls verfügbar. Benutze Genvorhersage- programm um Gene zu finden Analysiere regulatorische Sequenzen des Gens. Softwarewerkzeuge

Extrinsische und intrinsische Methoden Viele Verfahren kombinieren nun (a) Homologie-Methoden = „extrinsische Methoden“ mit (b) Genvorhersage-Methoden = „intrinsische Methoden“ Etwa die Hälfte aller Gene kann durch Homologie zu anderen bekannten Genen oder Proteinen gefunden werden (dieser Anteil wächst stetig, da die Anzahl an sequenzierten Genomen und bekannten cDNA/EST Sequenzen kontinuierlich wächst.) Um die übrige Hälfte an Genen zu finden, muß man prädiktive Methoden einsetzen. Softwarewerkzeuge Mathé et al. Nucl. Acids. Res. 30, 4103 (2002)

Beispiel: Vergleich von Glimmer und GeneMarksS Besemer et al. Nucl. Acids. Res. 29, 2607 (2003) Softwarewerkzeuge

Hidden Markov Models Ein Hidden Markov Modell ist ein Graph, der verschiedene Zustände verbindet. Jeder Zustand kann möglicherweise eine Reihe an Beobachtungen „aussenden“. Der Prozeß entwickelt sich in eine Richtung, z.B. die Zeit. Man parametrisiert das Modell mit Wahrscheinlichkeit für den Zustand zur Zeit t + 1, gesetzt dass die Zustände davor bekannt sind. Softwarewerkzeuge

TIGR: GlimmerM, Exonomy and Unveil Topologies of Unveil Exonomy 283-state HMM 23-state GHMM Majoros et al. Nucl. Acids. Res. 31, 3601 (2003) Softwarewerkzeuge

Methoden funktionieren nicht überall Ein Beispiel, in dem Exonomy die Gene richtig erkennt. Ein Beispiel, in dem GlimmerM die Gene richtig erkennt. Ein Beispiel, in dem Unveil die Gene richtig erkennt (auch Genscan). Majoros et al. Nucl. Acids. Res. 31, 3601 (2003) Softwarewerkzeuge

Zusammenfassung Die Resultate der Genvorhersage werden zuverlässiger; dennoch sollte man sie mit Vorsicht behandeln. Sie sind sehr nützlich um die Entdeckung von Genen zu beschleunigen. Dennoch sind biologische Techniken notwendig um die Existenz von virtuellen Proteinen zu bestätigen und um dessen biologischen Funktion zu finden bzw. zu beweisen. Dadurch werden vergleichende Genom-Ansätze immer wichtiger, in denen Programme Genkandidaten auf Homologie mit exprimierten Sequenzen vergleichen (EST oder cDNA Sequenzdaten). Neue Arbeiten wenden sich nun RNA-kodierenden Genen zu. Mathé et al. Nucl. Acids. Res. 30, 4103 (2002) Softwarewerkzeuge

Transkriptions – Gen-Regulationsnetzwerke Die Maschine, die ein Gen transkribiert, besteht aus etwa 50 Proteinen, einschließlich der RNA polymerase, ein Enzym, das DNA code in RNA code übersetzt. Eine Gruppe von Transkriptions- faktoren bindet an die DNA gerade oberhalb der Stelle des Kern-Promoters, während assoziierte Aktivatoren an Enhancer-Regionen weiter oberhalb der Stelle binden. http://www.berkeley.edu/news/features/1999/12/09_nogales.html a Softwarewerkzeuge

Promoter prediction in E.coli • To analyze E.coli promoters, one may align a set of promoter sequences by the position that marks the known transcription start site (TSS) and search for conserved regions in the sequences. • E.coli promoters are found to contain 3 conserved sequence features • a region approximately 6 bp long with consensus TATAAT at position -10 • a region approximately 6 bp long with consensus TTGACA at position -35 • a distance between these 2 regions of ca. 17 bp that is relatively constant a Softwarewerkzeuge

Feasibility of computational motif search? • Computational identification of transcription factor binding sites is difficult because they consist of short, degenerate sequences that occur frequently by chance. • The problem is not easy to define (therefore: it is „complex“) because • - the motif is of unknown size • - the motif might not be well conserved between promoters • - the sequences used to search for the motif do not necessarily represent the complete promoter • - genes with promoters to be analyzed are in many cases grouped together by a clustering algorithm which has its own limitations. Softwarewerkzeuge

Strategy 1 Arrival of microarray gene-expression data. Group of genes with similar expression profile (e.g. those that are activated at the same time in the cell cycle)  one may assume that this profile ist, at least partly, caused by and reflected in a similar structure of the regions involved in transcription regulation. Search for common motifs in < 1000 base upstream regions. Sofar used: detection of single motifs (representing transcription-factor binding sites) common to the promoter sequences of putatively co-regulated genes. Better: search for simultaneous occurrence of 2 or more sites at a given distance interval! Search becomes more sensitive. Softwarewerkzeuge

Motif-Identifizierung A flowchart to illustrate the two different approaches for motif identification. We analyzed 800 bp upstream from the translation start sites of the five genes from the yeast gene family PHO by the publicly available systems MEME (alignment) and RSA (exhaustive search). MEME was run on both strands, one occurrence per sequence mode, and found the known motif ranked as second best. RSA Tools was run with oligo size 6 and noncoding regions as background, as set by the demo mode of the system. The well-conserved heptamer of the motifs used by MEME to build the weight matrix is printed in bold. Ohler, Niemann Trends Gen 17, 2 (2001) Softwarewerkzeuge

Strategie 2: Erschöpfende Motivsuche in upstream-Regionen • Benutze Beobachtung daß relevante Motive sich in der upstream-Region oft viele Mal wiederholen, unter Umständen mit kleinen Variationen, damit die regulatorische Wirkung effektiv ist. • Suche in der upstream-Region nach überrepräsentierten Motiven • Ordne Gene nach den überrepräsentierten Motiven. • Analysiere Gruppen von Genen, die Motive für Ko-Regulation in Microarray-Experimenten gemeinsam haben. • Betrachte überrepräsentierte Motive, die Gruppen von koregulierten Genen als mögliche Bindungsstellen markieren. Cora et al. BMC Bioinformatics 5, 57 (2004) Softwarewerkzeuge

Erschöpfende Motivsuche in upstream-Regionen Exploit Cora et al. BMC Bioinformatics 5, 57 (2004) Softwarewerkzeuge

Aktuelle Verfahren um Promotoren zu finden Ohler, Niemann Trends Gen 17, 2 (2001) Softwarewerkzeuge

Positions-spezifische Gewichtsmatrix Populäres Verfahren wenn es eine Liste von Genen gibt, die ein TF-Bindungs-motiv gemeinsam haben. Gute MSAs müssen vorhanden sein. Alignment-Matrix: wie häufig treten die verschiedenen Buchstaben an jeder Position im Alignment auf? Hertz, Stormo (1999) Bioinformatics 15, 563 Softwarewerkzeuge

Positions-spezifische Gewichtsmatrix Beispiele für Matrizen, die von YRSA verwendet werden: http://forkhead.cgb.ki.se/YRSA/matrixlist.html Softwarewerkzeuge

3D Strukturen von Transkriptionsfaktoren 1AU7.pdb 1A02.pdb 1AM9.pdb TFs binden auf sehr unterschiedliche Weise. Manche sind sehr selektiv für die DNA-Konformation. 2 TFs bound! 1CIT.pdb 1GD2.pdb 1H88.pdb http://www.rcsb.org Softwarewerkzeuge

Datenbank für eukaryotische Transkriptionsfaktoren: TRANSFAC BIOBase / TU Braunschweig / GBF Relationelle Datenbank 6 Dateien: FACTOR Wechselwirkung von TFs SITE ihre DNA-Bindungsstelle GENE durch welche sie diese Zielgene regulieren CELL wo kommt Faktor in Zelle vor? MATRIX TF Nukleotid-Gewichtungsmatrix CLASS Klassifizierungsschema der TFs Wingender et al. (1998) J Mol Biol 284,241 Softwarewerkzeuge

Datenbank für eukaryotische Transkriptionsfaktoren: TRANSFAC BIOBase / TU Braunschweig / GBF Matys et al. (2003) Nucl Acid Res 31,374 Softwarewerkzeuge

TRANSFAC Klassifizierung 1 Superklasse basische Domänen 3 Superklasse: Helix-turn-helix 1.1 Leuzin-zipper Faktoren (bZIP) 1.2 Helix-Loop-Helix Faktoren (bHLH) 4 Superklasse: beta-Scaffold 1.3 bHLH-bZIP Faktoren mit Kontakt in der 1.4 NF-1 Minor Groove 1.5 RF-X 1.6 bHSH 5 Superklasse: andere 2 Superklasse: Zink-koordinierende DNA-bindende Domänen 2.1 Cys4 Zinkfinger vom Typ nuklearer Rezeptor 2.2 verschiedene Cys4 Zinkfinger 2.3 Cys2His2 Zinkfinger Domänen 2.4 Cys6 Cystein-Zink Cluster 2.5 Zinkfinger mit abwechselnder Zusammensetzung http://www.gene-regulation.com/pub/databases/transfac/cl.html Softwarewerkzeuge

TRANSFAC Datenbank Eintrag für 1.1 Leuzine-Zippers http://www.gene-regulation.com Softwarewerkzeuge

TRANSFAC Datenbank http://www.gene-regulation.com Softwarewerkzeuge

Zusammenfassung Es gibt große Datenbanken (z.B. TRANSFAC) mit Informationen über Promoterstellen. Diese Informationen sind experimentell überprüft. Microarray-Daten erlauben es, nach gemeinsamen Motiven von ko-regulierten Genen zu suchen. Auch möglich: gemeinsame Annotation in der Gene Ontology etc. TF-Bindungsmotive sind oft überrepräsentiert in der 1000 bp-Region upstream. Die klare Funktion davon ist unbekannt. Relativ wenige TFs regulieren eine große Anzahl an Genen. http://www.gene-regulation.com Softwarewerkzeuge

Identifizierung von Repeats: RepeatMasker RepeatMasker: durchsucht DNA Sequenzen auf - eingefügte Abschnitte, die bekannten Repeat-Motiven entsprechen (dazu wird eine lange Tabelle mit bekannten Motiven verwendet) und - auf Regionen geringer Komplexität (z.B. lange Abschnitt AAAAAAAA). Output: - detaillierte Liste, wo die Repeats in der Sequenz auftauchen und - eine modifizierte Version der Input-Sequenz, in der die Repeats „maskiert“ sind, z.B. durch N‘s ersetzt sind. Für die Sequenzvergleiche wird eine effiziente Implementation des Smith-Waterman-Gotoh Algorithmus verwendet. http://www.gene-regulation.com Softwarewerkzeuge

Whole Genome Shotgun Assemblierung Es gibt 2 Strategien für die Sequenzierung von Genomen: clone-by-clone Methode whole-genome shotgun Methode (Celera, Gene Myers). Die Shotgun Sequenzierung wurde bereits 1977 von F. Sanger et al. eingeführt und ist seither eine Standardmethode für die Sequenzierung von Genen. Umstritten war jedoch, ob man sie auch für komplette Genome verwenden kann. ED Green, Nat Rev Genet 2, 573 (2001) Softwarewerkzeuge

Arachne Programm • von Serafin Batzoglou (MIT, Doktorarbeit 2000) • konstruiere Graph G für Überlappungen zwischen Paaren von reads aus • Shotgun-Daten • prozessiere G um Supercontigs von gemappten reads zu erhalten. Wichtige Variation der whole-genome shotgun Sequenzierung: sequenziere reads jeweils von beiden Enden eines Klons. Da die Inserts nach ihrer Größe ausgewählt werden, ist damit der ungefähre Abstand zwischen dem Paar von reads bekannt. Man nennt diese earmuff(Ohrenwärmer) Verbindungen. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Arachne: erzeuge Überlappungsgraphen Liste von reads R = (r1, ..., rN) , N ist die Anzahl der reads. Jeder read ribesitzt eine Länge li< 1000. Wenn beide reads von den Endpunkten desselben Klons stammen (earmuff link), besitzt rieine Verknüpfung zu einem anderen read rjin einer festen Distanz dij. Erstes Ziel: erzeuge Graphen G der Überlappungen (Kanten) zwischen Paaren an reads (Knoten)  dies ergibt die Paare an reads in R, die aligniert werden müssen. Da R sehr lang sein kann, sind N2 alignments nicht praktikabel.  erstelle Tabelle für das Vorkommen vonk-Tupel (Strings der Länge k) in den reads, zähle die Anzahl von k-Tupel Treffern für jedes Paar an reads. Führe dann paarweise Alignments zwischen den Paaren an reads durch, die mehr als cutoff gemeinsame k-mere besitzen. Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-meren Ermittle die Anzahl an k-Tupel Treffern in der Vorwärts- und Rückwärts-Richtung zwischen jedem Paar von reads in R. (1) Ermittle alle Triplets (r,t,v) r = Nummer des reads in R t = Index eines k-mers, das in r vorkommt v = Richtung des Auftretens (vorwärts oder rückwärts) (2) sortiere die Menge der Paare nach den k-mer Indices t (3) verwende eine sortierte Liste um eine Tabelle T von Quadrubletts (ri, rj, f, v) zu erstellen, wobei riund ridie reads sind, die mindestens einen gemeinsamen k-mer enthalten, v die Richtung angiebt, und f die Anzahl an gemeinsamen k-mers zwischen ri und rjin Richtung v. Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-mers Hier: k = 3 Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-mers • Wenn ein k-Tupel „zu oft“ auftritt  gehört er wahrscheinlich zu einer • Repeat-Sequenz. • Man sollte diese nicht für die Detektion von Überlappungen verwenden. • Implementierung • finde k-Tupel(r,t,v) und sortieren sie in 64 Dateien entsprechen den ersten • drei Nukleotiden jedes k-mers. • Für i=1,64 • lade Datei in den Speicher, sortiere nach t, speichere sortierte Datei ab. • end • lade 64 sortierte Dateien nacheinander in den Speicher, • fülle Tabelle T nacheinander auf. • In der Praxis ist k = 8 bis 24. Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Arachne: paarweise read-Alignments Führe paarweise Alignments zwischen den Reads durch, die mehr als Cutoff gemeinsame k-mers besitzen. Sobald man zu häufige k-mers ausschließt (mehr als ein zweiter Cutoff), ist sichergestellt, daß nur O(N) viele paarweise Sequenzalignments durchgeführt werden müssen. Nur eine kleine Anzahl an Basen-Austauschen und Indels ist in einer überlappenden Region zweier alignierter reads erlaubt. Output des Alignment-Algorithmus: für die reads ri, rj gibt es Quadrubletts (b1, b2, e1, e2) für jede detektierte Überlappungsregion mit den Anfangspositionen b1, b2 und Endpositionen e1,e2. Falls eine signifikante Überlappungsregion vorliegt, wird (ri, rj, b1, b2, e1, e2) eine Kante im Überlappungsgraphen G. Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Kombination teilweiser Alignments 3 teilweise Alignments der Länge k=6 zwischen einem Paar von reads werden zu einem einzigen vollen Alignment der Länge k=19 kombiniert. Die vertikalen Linien verbinden übereinstimmenden Basen, wogegen x Mismatche sind. Dies ist eine oft auftretende Situation, in der ein ausgedehnter k-mer Treffer ein volles Alignment von zwei reads ist. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Repeats erzeugen Mehrdeutigkeit Ohne das Auftreten von Sequen-zierungsfehlern und Repeats wäre es einfach, alle entdeckbaren paarweise Abstände von reads zu finden und den Graph G zu konstruieren. Da es Repeats jedoch sehr häufig auftreten, bedeutet eine Verbindung zwischen zwei reads in G nicht ohne weiteres eine wahre Überlappung. Eine „Repeat-Verbindung“ ist eine Verbindung in G zwischen zwei reads, die aus verschiedenen Regionen des Genoms stammen und in der repetitiven Sequenz überein-stimmen. Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Sequence contigs unerläßlich für die Assemblierung ist die ausreichende Überdeckung (mehrfache Sequenzierung = coverage) derselben Genomregionen Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Verbinden von Contigs Durch die Löschung von k-mers hoher Frequenz wird einiges an Repetition im Genom vor der Erzeugung von G effizient maskiert. Zur Erkennung von repetitiven Verbindung dienen weitere heuristische Algorithmen, die hier nicht diskutiert werden sollen. Sequenz-Contigs werden gebildet indem Paare von reads verbunden werden, die eindeutig verbunden werden können. Tatsächlich ist die Situation viel schwieriger als hier gezeigt, da Repeats häufig nicht zu 100% zwischen Kopien konserviert sind. Batzoglou PhD thesis (2002) Softwarewerkzeuge

Benutze Überlapp-Paarungen um die reads zu verbinden Arachne sucht nach 2 Plasmiden mit gleicher Insert-Länge, deren Sequenzen an beiden Enden überlappen  paired pairs. (A) A paired pair of overlaps. The top two reads are end sequences from one insert, and the bottom two reads are end sequences from another. The two overlaps must not imply too large a discrepancy between the insert lengths. (B) Initially, the top two pairs of reads are merged. Then the third pair of reads is merged in, based on having an overlap with one of the top two left reads, an overlap with one of the top two right reads, and consistent insert lengths. The bottom pair is similarly merged. Unten: eine Menge von paired pairs werden zu contigs zusammengefasst und eine Konsensussequenz erzeugt. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Detection of repeat contigs Some of the identified contigs are repeat contigs in which nearly identical sequence from distinct regions are collapsed together. Detection by (a) repeat contigs usually have an unusually high depth of coverage. (b) they will typically have conflicting links to other contigs. Contig R is linked to contigs A and B to the right. The distances estimated between R and A and R and B are such A and B cannot be positioned without substantial overlap between them. If there is no corresponding detected overlap between A and B then R is probably a repeat linking to two unique regions to the right. After marking repeat contigs, the remaining contigs should represent the correctly assembled sequence. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Contig assembly If (a,b) and (a,c) overlap, then (b,c) are expected to overlap. Moreover, one can calculate that shift(b,c)=shift(a,c)-shift(a,b). A repeat boundary is detected toward the right of read a, if there is no overlap (b,c), nor any path of reads x1, ..., xksuch that (b,x1), (x1,x2) ..., (xk,c) are all overlaps, and shift(b,x1) + ... + shift(xk,c)  shift(a,c) – shift(a,b). Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Consistency of forward-reverse links • The distance d(A,B) (length of gap or negated length of overlap) between two linked contigs A and B can be estimated using the forward-reverse linked reads between them. • The distance d(B,C) between two contigs B,C that are linked to the same contig A can be estimated from their respective distances to the linked contig. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Contig Coverage and Read Usage Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Characterization of Contigs and Supercontigs Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Base Pair Accuracy base quality x*10 means that (on average) one sequencing error occurs in 10-x bases. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Computational Performance Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002) Softwarewerkzeuge

Vergleich verschiedener Assemblierungen • man sollte gucken nach: • - welche Methode gibt die kleinste Anzahl an Contigs bzw. die kleinesten Anzahl am festen Contigs bzw. falsch assemblierten Contigs • die größt mögliche Abdeckung durch Contigs • falsch assemblierte Contigs sollten einen möglichst geringen Teil des Genoms ausmachen. Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001) Softwarewerkzeuge

There is no error-free assembler to date Comparative analysis of EULER, PHRAP, CAP, and TIGR assemblers (NM sequencing project). Every box corresponds to a contig in NM assembly produced by these programs with colored boxes corresponding to assembly errors. Boxes in the IDEAL assembly correspond to islands in the read coverage. Boxes of the same color show misassembled contigs. Repeats with similarity higher than 95% are indicated by numbered boxes at the solid line showing the genome. To check the accuracy of the assembled contigs, we fit each assembled contig into the genomic sequence. Inability to fit a contig into the genomic sequence indicates that the contig is misassembled. For example, PHRAP misassembles 17 contigs in the NM sequencing project, each contig containing from two to four fragments from different parts of the genome. „Biologists "pay" for these errors at the time-consuming finishing step“. Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001) Softwarewerkzeuge

V4 – Analyse von Genomsequenzen