Mecanismos de Vascularização Estudo em dois modelos

1. Mecanismos de VascularizaçãoEstudo em dois modelos Ana Lúcia Cordeiro António Figueiredo Filipa Godinho Inês Martins Orientadora: Prof. Doutora Delminda Magalhães Regente: Prof. Doutora Deolinda Teixeira 23 de Maio, 2005

2. Vasculogénese: origina os vasos de grande calibre “de novo”, no embrião, a partir de percursores mesodermicos conhecidos por angioblastos. Angiogénese propriamente dita: ocorre após formação de grandes troncos vasculares em que estes últimos se ramificam e se distribuem numa rede vascular complexa. Este processo mantém-se durante toda a vida do indivíduo, dependendo de factores de crescimento vascular. Introdução • O que são mecanismos de vascularização? Angiogénese: mecanismo de proliferação de células endoteliais e musculares lisas para formarem novos vasos sanguíneos.

3. VEGF • Factor de crescimento vascular endotelial; • Regulador chave da angiogénese fisiológica durante a embriogénese, crescimento ósseo, funções reprodutivas; • Também está implicado na angiogénese patológica associada a tumores, desordens neovasculares intraoculares... • Pertence a uma família que inclui PlGF (Factor de crescimento placentário), VEGF B, C e D; • O gene do VEGF A humano está organizado em oito exões separados por sete intrões. O splicing alternativo resulta na formação de quatro isoformas com diferente número de ácidos aminados. • Analisou-se o VEGF A porque é o mais bem estudado e o mais importante ao nível do crescimento vascular.

4. Receptor de VEGF (VEGFR) • Os efeitos biológicos do VEGF são mediados por dois receptores: VEGFR-1 e VEGFR-2, ambos com acção da cínase da tirosina. • Estudou-se o VEGFR-2 porque este é aquele ao qual o VEGF se liga preferencialmente. • Modelos em estudo • Estudou-se o tecido cavernoso do pénis de rato devido às patologias que lhe estão associadas, nomeadamente a disfunção eréctil. • A glândula supra-renal foi estudada pois é um tecido muito vascularizado.

5. Objectivos • Familiarização com técnicas de microscopia e de laboratório. • Caracterizar a localização do VEGFR-2 no tecido do corpo cavernoso do pénis de rato. • Analisar as alterações na expressão e localização do VEGFR-2 no tecido do corpo cavernoso de pénis de rato. • Identificar as junções intercelulares de aderência. • Relacionar o estudo efectuado com patologias.

6. 1º dia • Desparafinar os cortes; • Hidratar em concentrações descendentes de etanol em água; • Inibição de peroxídase endógena, usando uma solução de metanol; • Aquecer 200 ml de tampão citrato no microondas até a ebulição; • Adicionar 100 µl de tampão de incubação; • Ligação do anticorpo primário ao corte. Métodos • Imunocitoquímica

7. 2º dia • Ligação do anticorpo secundário ao corte; • Adicionar cerca de 100 µl de solução de estreptavidina-biotina-peroxidase e incubar durante 30 min; • Adicionar solução de DAB/H2O2 ao corte e incubar durante 7 min; • Corar com hemateína; • Desidratar em etanol de concentrações crescentes e xilol; • Montar em Entellan; • Observar os cortes ao microscópio de luz.

8. Microscopia electrónica e de luz • Preparação de blocos de Epon: • Fixação; • Pós-fixação com tetróxido de ósmio; • Desidratação em etanol com concentrações crescentes; • Inclusão em Epon. • Preparação dos cortes: • Cortes efectuados no ultramicrótomo, usando uma faca de vidro – Cortes semi-finos e ultra-finos; • Os cortes semi-finos foram corados com azur, observados ao microscópio óptico e fotografados; • Os cortes ultra-finos foram colocados em grelha de cobre e contrastados com acetato de uranilo e citrato de chumbo, sendo posteriormente observados ao microscópio electrónico e fotografados com revelação dos negativos e passagem a papel por método de rotina do laboratório.

9. Microscopia de luz Imunocitoquímica Fig.1- Amostra controlo de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 20x. Resultados

10. Fig.2- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato adulto normal, com ampliação total de 20x.

11. Fig.3- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato idoso (18 meses), com ampliação total de 20x.

12. Fig.4- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato orquidectomizado, com ampliação total de 20x.

13. Coloração com Azur Fig.5- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato, com ampliação total de 20x.

14. Fig.6- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 40x.

15. Fig.7- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 20x.

16. Fig.8- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 40x.

17. Microscopia electrónica • Tecido cavernoso de pénis de rato Fig.9- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

18. Fig.10- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 9400x.

19. Fig.11- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

20. Tecido de supra-renal Fig.12- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 3400x.

21. Fig.13- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 5400x.

22. Conclusões • Foi possível confirmar a localização de VEGFR-2, o qual se encontra apenas nas células endoteliais, sendo a sua localização e expressão independentes das condições do animal. • Aquando da observação ao microscópio electrónico, não se conseguiu identificar junções intercelulares de aderência nas preparações de pénis de rato, contrariamente ao tecido de supra-renal onde estas estruturas eram claramente visíveis. • Relativamente às patologias dos tecidos mencionados, não foi possível retirar conclusões neste sentido.

23. Bibliografia • Soares T. Angiogénese: mecanismos e factores reguladores. RFML 2003; Série III; 8 (5): 319-325. • Bazzoni G, Deyana E. Endothelial Cell-to-Cell Junctions: Molecular Organization and Role in Vascular Homeostasis. Physiol Rev 84: 869-901, 2004. • Carmeliet P. Mecanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med.2000; 6: 389-95. • Costa C, Soares R, Schmitt F. Angiogenesis: Now and then. APMIS 2004; 112: 00-00. • Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003; 9 (6): 669-674. • http://mphywww.tamu.edu/Movies/angio.mpg

24. Agradecimentos • Professora Doutora Delminda Magalhães • Professor Doutor Henrique de Almeida • Sr. Vitor Hugo Mata • Sr. D. Amélia Sarmento Ferreira

25. Obrigado pela atenção!