J.S. Pita, V.N.Fondong, A.Sangaré, W.Otim-Nape, S.Ogwal and C.M.Fauquet

1. Recombination, pseudorecombination and synergism of geminiviruses are determinant keys to the epidemic of severe cassava mosaic disease in Uganda J.S. Pita, V.N.Fondong, A.Sangaré, W.Otim-Nape, S.Ogwal and C.M.Fauquet Journal of General Virology, 2001

2. Mosaïque du manioc (CMD) • Principale maladie causant des pertes importantes • Répartition géographique: Afrique et Inde • Symptomatologie : malformations, distorsions du limbe, couleur jaunâtre • Transmission : dissémination des boutures, mouche blanche • Moyens de lutte : sélection de boutures saines, insecticide Bemisia tabaci

3. Mosaïque du manioc (CMD) • Agent causal : virus émergeant des plantes geminivirus • 4 virus: ACMV(African Cassava mosaic Virus) EACMV/ICMV/SACMV • Virus à ADN circulaire simple brin non enveloppé bipartite, encapsidé • 2 segments A et B possédant une région commune CR à forte homologie: • A = P réplication et encapsidation viral • B = 2P jouant un rôle dans la dissémination du virus à travers la plante

4. Mosaïque du manioc (CMD) • Épidémiologie : • 1928 = 1 ère apparition de la CMD en Uganda • 1933-1944 = sévères épidémies contrôlées • 1988 = épidémie sévère progressant rapidement du nord vers le sud => famines Etude pcdte =>Corrélation entre la présence du nv virus recombinant ACMV+EACMV et la sévérité de l’épidémie

5. Objectif de l’étude • Meilleur compréhension des dynamiques de l’épidémie • A partir de l’observation des plantes récoltées ainsi que celles obtenues en serres et des résultats de PCR et de southern blot

6. Recueil d’échantillons • 80 sites (sud ouest, centre et nord), 183 prélèvements avec symptômes sévères (90%) et bénins • 9 cultivars • Mouches blanches

7. 1/Reproduction des symptômes dans un environnement contrôlé • 70.5% de succès • L’échec de la culture n’est pas lié à la sévérité des symptômes • Seules les boutures développant les mêmes symptômes dans les 2 conditions de cultures sont conservées pour l’étude après 70 j • Les symptômes • ≠ de sensibilité selon les cultivars : 8 à 32% de mort léger Sévère

8. 2/Caractérisation moléculaire des geminivirus par PCR • Utilisation de primers permettant d’amplifier le gène codant pour CP • Nv geminivirus EACMV-UG3 • Pas d’infection par ICMV et SACMV en Uganda

9. 3/Relation entre CMV, sévérité des symptômes et accumulation d’ADN • Relation CMV/sévérité des symptômes • Action synergique entre les 2 espèces de virus • Sélection du cultivar Ebwanatereka pour la suite de l’étude • Reproduction des symptômes chez N.benthamiana • Extraction de sève puis inoculation à ≠ concentrations, contrôlée par PCR • Selon le virus EACMV-UG2 et ACMV-UG, sévérité des symptômes ≠

10. 3/Relation entre CMV, sévérité des symptômes et accumulation d’ADN • Relation accumulation ADN/sévérité des symptômes Southern blot • Il existe une relation positive entre l’accumulation d’ADN et la sévérité des symptômes EACMV-UG2/Mld ACMV-UG +EACMV-UG2 EACMV-UG2/Svr

11. 4/Analyse des séquences d’ADN et comparaison • CP • Séquences très proches • Tous les EACMV-UG2 possèdent le même fragment recombinant provenant de ACMV • DNA-A • Grande homologie de Séquence pour chaque espèce

12. 4/Analyse des séquences d’ADN et comparaison • Preuve que EACMV-UG3 provient d’une recombinaison • Séquençage de ADN-B de EACMV-UG1 et -UG3 =>comparaison du % d’identité de BC1 et BV1 • ACMV et EACMV = 2 espèces distincts • BV1 a la plus grande variabilité entre les 2 espèces • 97% d’homologie entre EACMV-UG1 et -UG3 BC1 BV1

13. 4/Analyse des séquences d’ADN et comparaison • % identité entre les CR de A et B • 3 importants clusters EACMV, EACMV-UG3 et ACMV • EACMV-UG2 et EACMV-UG3 = 60% d’homologie • EACMV-UG3 provient d’une recombinaison avec une autre espèce

14. 5/Existence de pseudorecombinaison naturelle entre les différents geminivirus du manioc • Dans la collection de plantes • PCR, primers spécifiques • JSP 017 et JSP 018 =>ACMV DNA-B • Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-UG2 DNA-A possèdent aussi ACMV DNA-B • Primers spécifiques de EACMV-UG3 et UG1 • Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-UG2 DNA-A possèdent aussi EACMV-UG3 DNA-B • Dans la collection de mouches • PCR, même primers • Présence de ACMV et EACMV-UG2 • Présence de mélanges =>transmission est non spécifique

15. 5/Existence de pseudorecombinaison naturelle entre les différents geminivirus du manioc • Inoculation par biolistique de clones de EACMV-UG2 et EACMV-UG3 • EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B présents dans les mêmes champs malgré leur faible identité , EACMV-UG2 A pourrait répliquer EACMV-UG3 B ? • Infectivité du pseudorecombinant • Symptômes chez les plantes • Southern blot, PCR =>Réplication • Il existe un phénomène de pseudorecombination chez les geminivirus

16. 6/Distribution géographique des geminivirus en Uganda • Région centrale et nord est • EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B • 24% possèdent aussi ACMV-UG A et B • Symptômes svr+++ • Région du Sud • Kampala, bord du lac Victoria • ACMV, sptm léger +++ • Combinaison, sptm svr • Masaka-Kasese • EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B • Symptômes svr+++ • Bunyangabu -Fort portal • ACMV, sptm svr • Fort portal • ACMV, EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B, EACMV-UG1 A et B, sptm svr • Kampala • EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B, sptm varié EACMV-UG2/Svr DNA-A + EACMV-UG3 DNA-B (rouge) EACMV-UG2/Mld (jaune) ACMV-UG/Svr (bleu) ACMV+EACMV (orange) ACMV-UG/Mld (vert) EACMV-UG1 DNA-A +EACMV-UG3 DNA-B

17. Discussion • Confirmation de la présence de ACMV, EACMV-UG1 (non-recombinant) et UG2 et découverte de la présence d’un nv virus EACMV-UG3 • Les symptômes observés dans les champs peuvent être reproduits en chambre de culture et chez N.Benthamiana • Il existe une corrélation positive entre la sévérité des symptômes et l’accumulation d’ADN suggérant l’existence de souches plus ou moins virulente qui définissent des aires géographiques et explique comment l’épidémie s’est répandue • ACMV /svr= régions montagneuse • ACMV/Mld = rives du lac Victoria (zone non atteinte lors de l’enquête) • EACMV-UG2/svr = partout, EACMV-UG2/Mld = poches • PCR et séquençage confirment que EACMV-UG2 Mld et svr possèdent le même fragment recombinant de ACMV sans pour autant exprimer les mêmes symptômes(mutation de la souche?)

18. Discussion • Les zones de contact entre les 2 ppaux virus montre que les infections mixtes proviennent de recombinaison • Il existe un phénomène de pseudorecombinaison entre EACMV-UG2 A et ACMV –UG B • L’intensité des symptômes peut être liée à une interaction synergique des 2 v ACMV et EACMV-UG2 s’expliquant par une plus grande accumulation d’ADN • EACMV-UG3 est dû à une recombinaison interespèce • Pseudorecombinant EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B est infectieux, le + fqt car s ’acc ds feuilles jeunes cible préférentielle de la mouche blanche. =>clé de l’épidémie car pseudorecombinants se répliquent +, s’acc + et entraînent des sptm +svr Transmission préférentielle de v recombinant expliquerait l’émergence de EACMV-UG2 et la EACMV-UG1 L’arrivée de EACMV-UG2 dans les zones où ACMV étaient prédominant=>action synergique, dvpmt de l’épidémie

19. Dynamiques de l’épidémie en Uganda • Synergisme entre ACMV et EACMV acc en ADN et transmission • Le fait que EACMV-UG2 soit recombinant expliquerait qu’il soit le + répandu mais existence de souche moins virulentes possédant la même recombinaison, mutations?sélection de ces souches par les agriculteurs? • Existence de pseudorecombinants stables entre ADN-A et B des souches d’une même espèce ou d’une espèce différente augmentation des possibilités de survie et source de biodiversité Il faut pls événements pour provoquer une épidémie Etudes complémentaires pour une meilleur compréhension avec l’utilisation de clones maintenant disponibles