Tossicologia e doping un nuovo metodo analitico

1. Università degliStudi di Genova Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie Corso di Biotecnologie Diagnostiche Docenti: Professor Giovanni Melioli e Professor Oliviero Varnier Tossicologia e dopingun nuovo metodo analitico 9 giugno 2005 Paola Pagani

2. Gli argomenti • L’origine del doping • Il THG e la sua identificazione

3. Le origini Doping = dall’inglese “to dope” Assunzione di sostanze non consentite, farmacologiche o fisiologiche in quantità anomala, per incrementare le prestazioni dell’organismo

4. Il doping e la sua storia • prime olimpiadi: uso di sostanze stimolanti • III sec a.C.: infusi di funghi applicati localmente come impacchi, a scopo stimolante • 1896 (vengono reintrodotte le moderne olimpiadi) Assunzione di sostanze zuccherine, caffè, alcool ma anche stricnina e nitroglicerina • 1950 (secondo dopoguerra) anfetamine -dai militari impegnati sui fronti di guerra agli sportivi. Problema dell’Est Europa • fine '80- inizio '90 enfatizzazione degli aspetti estetici degli atleti. Diffusione anche a livelli sportivi dilettantistici e amatoriali

5. Sostanze dopanti Numerosissime Difficili da catalogare Aggiornamento continuo dell’elenco previsto dalla normativa (Legge n.376/2000)

6. Le principali sostanze proibite

8. Tetrahydrogestrinone (THG) • Steroide anabolizzante di nuova concezione sintetizzato con relativa facilità dalla riduzione catalitica del gestrinone. • Androgenico e progestinico (meccanismo d’azione ancora non chiaro) • Vantaggi: 1. facile da produrre • 2. mantiene lo stesso effetto del gestrinone • 3. NON viene rilevato con i normali metodi di screening

9. Procedura per la ricerca di steroidi anabolizzanti assunti da atleti 1. La scelta del campione • test “a sorpresa” nei periodi di preparazione • Il campione di urina dell’atleta viene diviso in due aliquote A e B, sigillate per evitare eventuali contraffazioni. Le analisi si eseguono su uno dei campioni (ad es. sul campione A). • Perché urina? • Prelievo non invasivo • Volumi elevati, facili da ottenere • Le sostanze (o loro metaboliti) sono reperibili in concentrazioni > rispetto agli altri fluidi • Le sostanze (o loro metaboliti) sono stabili quando congelati per un certo periodo

10. 2. La conservazione del campione Deve essere corretta e idonea in modo da consentire la ripetizione, in qualsiasi momento, dell’indagine della sostanza

11. 3. L’analisi del campione Cromatografia o estrazioni Derivatizzazione Campione di urine Arrichimento in steroidi GC- MS • Se campione positivo→ analisi su nuova aliquota A per conferma. • Se test di conferma positivo→ controanalisi eseguite sul campione B. All’atleta o ad un suo rappresentate è permesso assistere all’analisi dell’altro campione.

12. Fase mobile Trasforma la sostanza in ione separazione rapporto m/z Fase stazionaria istogramma che riporta l’abbondanza ionica in funzione del rapporto m/z. GC- MS Principio: Il riconoscimento di un particolare steroide avviene in base al tempo di ritenzione cromatografico e dallo spettro di massa caratteristico MS

13. Problematiche nell’analisi del THG Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urineRapid Communications in Mass Spectrometry 2004, 18, 1245-1249Don H. Catlin, Michael H. Sekera, Brian D. Ahrens, Borislav Starcevic, Yu-Chen Chang and Caroline K. Hatton Discovery, Biosynthesis and Structure elucidation of Metabolites of Doping Agent and a direst Analogue, Tetrahydrogestrione and Gestrinone, Using Human Hepatocytes Anal. Chem. 2005, 77, 3164 -3172 J.F. Levesque, E. Templeton, L. Trimble, C. Berthelette, and N. Chauret Elaborazione di un nuovo metodo analitico utilizzando HPLC-MS/MS e HRMS • Poco stabile nelle normali condizioni di derivatizzazione e di analisi • Spettro GC-MS di difficile interpretazione, difficoltà di assegnazione univoca

14. HPLC-MS/MS e HRMS I vantaggi rispetto alla GC-MS HPLC:adatto per sostanze termolabili non occorre derivatizzare MS/MS :permette di ottenere spettri di frammentazione specificatamente correlabili alla struttura di un certo analita. 1. tempo di ritenzione cromatografico + 2. massa dell’analita + 3. spettri di frammentazione dato univoco e incontestabile HRMS:permette di assegnare ad un certo valore del rapporto m/z una formula molecolare univoca

15. 4. I risultati Il THG è presente nelle urine sia tal quale che coniugato. A livello epatico: THG Glucuronizzazione (cit. p450 3A) M1 M2 M3 M4 metaboliti

16. Spettro MS Ioni Frammento Spettro MS/MS HPLC-MS/MS applicato a un coniugato del THG (THG-glucoronide) 1° info : tempo di ritenzione Cromatogramma 2° info : “peso” della molecola 3° info : fingerprint legato ad una specifica struttura

17. Il fatto Giugno 2003:uno sconosciuto, probabilmente un allenatore, fece recapitare all’ United States Anti-Doping Agency (USADA) una siringa usata con resti di una sostanza non identificata contenente un nuovo tipo di sostanza anabolizzante non rintracciabile, sintetizzato da un laboratorio di San Francisco, la Balco Laboratories. Questa sostanza fu inviata all’ Olympic Analytical Laboratory (UCLA) di Los Angeles dove venne analizzata dal gruppo del dr. Caitlin (uno dei 30 laboratori mondiali di riferimento riconosciuti dal CIO e l’unico accredidato negli USA dal CIO stesso e dall’ Word Anti- Doping Agency (WADA).

18. Il caso Marion Jones : Indagata per l’assunzione di THG. olimpiadi Sidney 2000: 5 medaglie oro nei (100, 200 e 4x400) m • L’accusa: • Il fondatore del laboratorio Balco dichiara:Jones assidua cliente dall'ago 2000 a sett 2001 e avrebbe preso praticamente di tutto: Epo, ormoni della crescita, insulina e una forma di Thg • assegno del valore di 7350 dollari firmato dalla Jones a beneficio di Victor Conte, datato anno 2000. In quell'anno la Jones seguì presso il Balco una cura ricostituente (lecita) a base di ZMA, un integratore alimentare contenente zinco e magnesio. • dichiarazioni dell'ex marito C.J. Hunter. “Marion Jones fece uso di doping a Sydney.” • l’allora marito, il lanciatore del peso C.J. Hunter, squalificato per steroidi • Tim Montgomery, l'attuale compagno della Jones, recordman dei 100 metri e accusato dall'agenzia statuitense antidoping di aver fatto uso di sostanze illecite. • La difesa: • non è stata mai trovata positiva ad alcun controllo antidoping • La situazione attuale • 22/04/2005 - Ritardata la causa della Jones contro Conte: il caso è ancora aperto

19. Considerazioni progresso in campo tecnologico sviluppo di metodi diagnostici sempre più sensibili e specifici, che permettono l’identificazione, la caratterizzazione e soprattutto quantificazione di molecole crescente aumento di sostanze sintetizzate difficoltà a stare al passo se il metodo per identificare il THG fosse già stato operativo all’epoca delle Olimpiadi del 2000 il caso M.Jones avrebbe avuto un esito meno incerto.

20. Grazie per l’attenzione!