Elisabeth Huguet Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte

1. La double vie d’un virus fascinant impliqué dans des interactions hôtes-parasites chez les insectes Elisabeth Huguet Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé Publique Septembre 2008 Université F. Rabelais, Tours UMR CNRS 6035 France

2. Cotesia congregata parasite la chenille Manduca sexta

3. Conséquences du parasitisme X X X Cotesia congregata (Guêpe Braconidae) Arrêt du développement Immunosuppression X X X Manduca sexta

4. Implication d’un troisième partenaire ? X X X Arrêt du développement Immunosuppression X Cotesia congregata bracovirus Manduca sexta Cotesia congregata (Guêpe Braconidae)

5. Le virus est indispensable à la réussite parasitaire Oeufs de guêpe + Virus Oeufs de guêpe lavés (sans virus) Oeufs de guêpe + Virus + psoralène Blocage expression virus (Beckage et al,1994) (Edson et al, 1981)

6. Le virus existe sous deux formes … Virus DNA MW 45 kb 40 kb 35 kb 30 kb 25 kb 20 kb 15 kb 10 kb 7.5 kb 5 kb Cette forme est présente en large excès dans les ovaires des femelles guêpes 2.5 kb FIGE 1. Une forme virale « libre » constituée de multiples cercles d’ADN double brin

7. Le virus existe sous deux formes … ADN guêpe 5 kb Sonde ADN viral « EP1 » Taille attendue 5 kb Sonde ADN viral « EP1 » Signal non attendu !

8. Le virus existe sous deux formes … PV4 PV10 EP1  6 9 5 4 3 10 1 8 2 7 1. Une forme virale linéaire intégrée au génome de la guêpe Expériences d’hybridations in situ sur chromosomes de guêpes Belle et al., 2002

9. Le virus existe sous deux formes … Dans la guêpe : Transmission verticale à la descendance Réplication Peu d’expression des gènes viraux Dans la chenille : Pas d’intégration dans le génome PAS de réplication Expression forte des gènes viraux

10. 5 Réplication virale Oviposition Injection de virus Dérégulation de la physiologie de l’hôte Succès parasitaire de la guêpe Expression des gènes viraux Production de protéines virales Cotesia congregata bracovirus est indispensable à la réussite parasitaire de la guêpe

11. Succès du parasitisme Génome intégré (chromosome 5) Protéines de capsides Alteration dudeveloppement Alteration de l’immunité Production des cercles viraux Formation virales Injection des particules virales Cellules ovariennes de C. congregata Manduca sexta Cycle du bracovirus de Cotesia congregata REPLICATION & MORPHOGENESE VIRALES EXPRESSION DES GENES DE VIRULENCE Expression des gènes viraux

12. Symbioses : mutualisme/parasitisme Virus qui joue un rôle central Association mutualiste Avec une guêpe Association parasitaire Avec une chenille Sans le virus la guêpe ne peut pas assurer sa descendance Sans la guêpe le virus ne peut pas se répliquer et se transmettre : virus ayant perdu son autonomie

13. Bracovirus Ichnovirus > 17000 espèces de guêpes Braconidae > 14000 espèces de guêpes Ichneumonidae Associations virus-guêpes

14. Deux familles de virus associées à deux familles de guêpes 35 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Ichneumonidae Campopleginae Banchinae 14000 espèces Ichnovirus Ichneumonoidae 34 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Braconidae Complexe Microgastroïde (7 sous familles) 17000 espèces Bracovirus Origine indépendante de l’association virus-guêpe chez les guêpes Braconidae et Ichneumonidae

15. Virus ancêtre Meteorinae Macrocentrinae Cheloninae Cheloninae BRACONIDAE Miracinae Miracinae >17000 espèces MICROGASTRINAE-Cotesia MICROGASTRINAE Cardiochilinae Cardiochilinae Doryctinae Braconinae Guêpe ancêtre (70 millions d’années) Aphidiinae Opiinae Alysiinae Origine des associations guêpes braconidae-virus

16. Quel est la nature du virus ancêtre ? Virus ancêtre BRACONIDAE Les questions scientifiques Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?

17. Les stratégies utilisées Quel est la nature du virus ancêtre ? Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Séquençage du génome viral libre Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

18. Séquençage de la forme libre du virus Génome de C. congregata Bracovirus (CcBV) • 30 cercles d’ADN db • 567 kb • 27 % de régions codantes • 156 gènes potentiels • Organisation en familles multigéniques Espagne et al. Science 2004

19. Contenu du génome de CcBV

20. Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ? • Très peu de gènes « viraux » • 1 gène de baculovirus • 1 gène d’ascovirus • gènes de rétroéléments DIRS et Dong • gènes de polintons • Ne renseignent pas sur la nature du virus ancêtre

21. Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ? • Familles multigéniques à motifs conservés: • Protéines-Tyrosine-Phosphatases • Inhibiteurs NFKB : IKB • Cystatines • Protéines riches en cystéines • Potentiellement de nombreux facteurs de virulence • impliqués dans dérégulation de la physiologie de la chenille

22. Découpage Clonage séquençage ADN viral Digestion enzymatique • Protéines • Tyrosines Phosphatases • Inhibiteurs NFKB • Cystatines Analyse des gènes exprimés par reverse northern. Sonde P32 d’ADNc chenilles non parasitées Sonde P32 d’ADNc chenilles parasitées

23. Gènes de la famille des IκB • Gènes codant pour protéines IκB interviennent dans la régulation de la réponse immunitaire innée chez les mammifères et les insectes (voies Toll) • Interaction avec le facteur de transcription NF- κB • Motif présent dans toutes les protéines IκB : domaine de répétitions ankyrines Gènes IκB-like chez les bracovirus et ichnovirus 9 gènes IkB chez CcBV

24. Champignons Bacteries Gram+ Activation de peptides antimicrobiens Voie Toll chez la Drosophile Toll Tube IkB (Cactus) Pelle NFkB (Dorsal) noyau

25. Activation de la réponse antiparasitaires Modèle du mode d’action des IkB virauxsur l’immunité chez Manduca Reconnaissance guêpe parasite Toll-like IkB NFkB noyau

26. X Pas d’activation de gènes de l’immunité Modèle du mode d’action des IkB virauxsur l’immunité chez Manduca Reconnaissance guêpe parasite Toll-like IkB viraux Injection de CcBV IkB NFkB noyau

27. Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ? • Familles multigéniques à motifs conservés: • Protéines-Tyrosine-Phosphatases • Inhibiteurs NFKB : IKB • Cystatines • Protéines riches en cystéines

28. 3 Cercle 19 1 2 3 Cystatines Implication des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?

29. QxVxG PW G • Cibles des cystatines : • protéases à cystéine de la famille C1 • Ex : papaine et cathepsine Cystatines ? • Cystatines = inhibiteur de protéases à cystéine • Cystatines de type 2 • Première description de cystatines virales • Chez les nématodes parasites les cystatines sont des facteurs de virulence

30. Sarcophaga Mouche tsetse Drosophile CathepsinB Cathepsin L Cathepsin L 26/29 kDa C1 cysteine protease Surexpression (ARNm) Surexpression (ARNm) Libération De protéase Cystéine protéases ciblées chez les insectes ? Protéases à cystéine (type C1) des insectes : • Digestion • Développement (métamorphose et mue) • Immunité ?

31. Quel est le rôle des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ? • Evolution moléculaire des cystatines virales • Est-ce que les cystatines virales sont exprimées ? • Les cystatines virales sont-elles des protéines inhibitrices • fonctionnelles ? • Quelles sont les cibles des cystatines virales chez Manduca ?

32. Analyse par Northern Corps gras Hémocytes ARNm actine ARNm cystatines Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite

33. Analyse par Western Hemolymphe P NP KDa 32,5 25 16,5 Cystatines (13 kDa) Anticorps Anti-Cystatine1 Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite

34. Fractions élution Expression et purification d’une protéine recombinante Cystatine 1 • Expression de CcBV cystatine1 dans des cellules d’insectes Hi5 • Purification sur colonne de papaïne Cystatine 1

35. Papain Relative Activity (%) Cystatine 1 (nM) Relative Activity (%) Cathepsin B Cathepsin L S. peregrina 29 kDa cysteine protease Cystatine 1 (nM) CcBV Cystatine 1 recombinante est un inhibiteur de protéases à cystéine actif Espagne et al. Journal of Virology 2005

36. Parasitisme Œufs de guêpe + bracovirus Inhibition par les cystatines de CcBV ? Production de protéases à Cystéine Modèle de travail _ Perspectives Nouvelle composante de la réponse immunitaire des insectes ?

37. Les questions scientifiques Quel est la nature du virus ancêtre ? Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Séquençage du génome viral libre ? Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

38. Nature du virus ancêtre ? Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes Chromosome 5 guêpe Pas de réplication dans la chenille hôte Les gènes viraux n’ont pas besoin d’être codés par les cercles Les gènes viraux sont exprimés massivement dans les ovaires Les gènes viraux sont dans le génome de la guêpe ?

39. Nature du virus ancêtre ?Nouvelle stratégie Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes 1. Recherches de protéines virales (capside, polymérase, enveloppes) Par une approche transcriptomique et protéomique sur les ovaires -banque EST d’ovaires de guêpes -analyse des protéines à partir de virus purifiés des ovaires 2. Analyse de la forme intégrée du virus

40. 44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte) • Gènes impliqués dans • la transcription • La constitution des nucléocapsides • La constitution des enveloppes des particules Analyse du transcriptome d’ovaires répliquant le virus: 6000 EST d’ovaires de Cotesia congregata Comparaison dans les banques de données Identification des protéines de structure des virions: Séquençage des protéines constitutives des particules purifiées Comparaison dans les banques de données et les banques d’EST Gènes viraux sont intégrés au génome de la guêpe

41. Le génome du virus reflète les contraintes évolutives différentes :mutualisme/parasitisme 1. Intégration du virus ancêtre 2. « Perte de gènes viraux » Transfert vers le génome de la guêpe 3. « Acquisition de gènes de virulence» Transfert du génome de la guêpe vers le virus

42. Encore beaucoup de questions Quel est la nature du virus ancêtre ? Comment s’effectue la réplication ? Virus comme vecteur de transfert de gènes ? Capture des gènes et évolution ? Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Mécanismes ?