Doktorand: Mr.sc. Maja Marinović Guić , drd. Mentor: Prof.dr.sc. Ivica Grković , drd.

1. Karakterizacija spinalnih aferentnih neurona koji se projiciraju u različite komore srca mladih i starih štakora Doktorand: Mr.sc. Maja Marinović Guić, dr.med. Mentor: Prof.dr.sc. Ivica Grković, dr.med. Split, 19. svibnja 2010.

2. Uvod: srčana inervacija Eferentna: simpatička i parasimpatička Aferentna: spinalna i vagalna

3. Hipotetski model srčane neuronalne hijerarhije Armour JA. Cardiac neuronal hierarchy in health and disease. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004 Aug;287(2):R262-71.

4. Uvod: distribucija srčanih spinalnih aferentnih neurona • Pas: obostrani C6-T6, najviše T2-T4 (Hopkins 1989) • Mačka: C8-T9, najviše u T3 (Kuo 1984) • Štakor: • Distribucija spinalnih aferentnih neurona? • Aferentna inervacija različitih srčanih komora?

5. Uvod: neurokemijske karakteristike srčanih spinalnih aferentnih neurona • Desni i lijevi ventrikul psa zajedno (Hoover 2008) CGRP ~30%, SP i nNOS (~62% neurona u T3 su bili negativni na ove markere); IB4 samo na jednoj životinji • Fiziološke studije koje su snimaju akcijske potencijale iz različitih srčanih komora su pokazale da postoje receptori mijeleliniziranih i nemijeliniziranih vlakana koji reagiraju na mehaničku stimulaciju u LA (Uchida 1974), LV (Uchida 1974), kao i u DA i DV psa (Uchida 1975).

6. Uvod: starenje i živčani sustav SRCE: ↑srčane mase, ↓ broj kardiomiocita (Ferrari 2003);↓ broj intrakardijačnih neurona (Akamatsu 1999) SŽS: ne smanjuje se ukupan broj neurona, ali se mijenja odnos međupotpornim stanicama (Hayakawa 2007); ↓ calretin+ neurona u moždanoj kori (Bu 2003) Nodozni ganglij: vagalni osjetni neuroni nisu puno promijenjeni u starosti (Soltanpour 1996) Spinalni gangliji (DRG): 12% neurona u lumbalnim DRG je nestalo u starosti, ali je omjer nemij./IB4+ i mijel./N52+ ostao isti (Bergman 1998); broj neurona u L6 i S1 ostaje isti (Mohammed 2001) Starenje je proces koji selektivno zahvaća određene subpopulacije neurona (↓ mijeliniziranih neurona, a nemijelinizirani su pošteđeni u kralježničnoj moždini-Bergman 2002)

7. Problematika i cilj istraživanja Ukupan broj i distribucija srčanih aferentnih neurona u spinalnim ganglijima štakora je nepoznat Razlika u broju i neurokemijskim karakteristikama među spinalnim aferentnim neuronima koji se projiciraju u različite komore srca štakora nije opisana Nisu opisane ni kvantitativne ni kvalitativne promjene ovih neurona u starosti Cilj je: 1) utvrditi raspodjelu aferentnih neurona u spinalnim ganglijima štakora kao i njihove neurokemijske karakteristike ovisno o komori srca koja je označena retrogradnom neuronalnom bojom Fast Blue-om, 2) istražiti mijenjaju li se broj i neurokemijske karakteristike srčanih spinalnih aferentnih neurona tijekom starenja

8. Hipoteze 1. Aferentni neuroni u spinalnim ganglijima koji se projiciraju u različite komore srca štakora imaju različite neurokemijske karakteristike utvrđene pomoću tri markera: izolektina B4, neurofilamenta 200 i kalretinina. 2. Starenjem će se smanjiti broj srčanih aferentnih neurona u spinalnim ganglijima štakora. 3. Starenje će dovesti do promjene neurokemijskih karakteristika srčanih aferentnih neurona u spinalnim ganglijima štakora na način da će se smanjiti postotak izolektin B4-pozitivnih, neurofilament 200-pozitivnih i kalretinin-pozitivnih FB-obojenih neurona u različitim omjerima.

9. Sadržaj i metode istraživanja • Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta u Splitu u skladu sa smjernicama za rukovanje laboratorijskim životinjama (European Communities Council Directive 24.11.1986.) nakon što je prethodno dobiveno odobrenje Etičkog povjerenstva Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu. • 24 Sprague-Dawley štakora podijeljena u dvije brojčano jednake skupine • Svaka skupina podijeljena je u po četiri podskupine (LK, LP, DK, DP) s obzirom na komoru srca koja će se označavati retrogradnom neuronalnom bojom Fast Blue (FB) 1) mladi štakori 2mj, 160-180g 2) stari štakori 24 mj, 300-350g

10. Sadržaj i metode istraživanja • nanošenje retrogradne neuronalne boje FB pomoću naljepka na srce tijekom operativnog zahvata transdijafragmalnim putem • žrtvovanje 7 dana nakon operacije, odstranjivanje srca, pluća, obostranih spinalnih ganglija od C6 do T6 razine, kralježnične moždine od C3 do C5 razine

11. Sadržaj i metode istraživanja • provjera mjesta aplikacije naljepka na određeni dio srca, • brojanje ukupnog broja FB-pozitivnih neurona u svim spinalnim ganglijima • uklapanje, smrzavanje, rezanje

12. Imunohistokemija • Neurofilament 200 (N52) – fosforilirani i defosforilirani teški lanac neurofilamenta 200kD koji se nalazi u živčanim stanicama (marker mijeliniziranih neurona Bergman 1999; Dirajlal 2003) • Izolektin B4 (IB4) – protein ili glikoprotein neimunološkog porijekla dobiven iz Griffoniae simplicifoliae koji se veže na ugljikohidratni dio glikoproteina (jaka reaktivnost na nemijelinizirane neurone-Streit 1985; Wang 1994; Bergman 1999; Stucky 1999; Gerke 2002; Fang 2006) • Kalretinin – 29 kD kalcij-vežući protein koji se nalazi u središnjem i perifernom živčanom sustavu (ima ulogu u nociceptivnim i proprioceptivnim putovima; Ren 1993; Ichikawa 2005; važnu ulogu u održavanju intracelularne razine Ca2+; Kirischuk 1996)

13. Statistički postupci • Broj stanica kao i njihov promjer izrazit će se kao aritmetička sredina ± standardna devijacija. Učestalost imunopozitivnosti FB-om označenih neurona prikazat će se kao postotak imunopozitivnih neurona unutar svake skupine popraćen sa stvarnim brojkama u zagradama. • Kolmogorov-Smirnov test koristit će se za utvrđivanje raspodjele broja neurona nakon kojeg će slijediti t-test ili ANOVA ukoliko distribucija bude simetrična, ili Mann-Whitney U test i Kruskal-Wallis ukoliko ne bude (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). • Budući da smo utvrdili da nije bilo razlike među neuronima koji se projiciraju u određenu srčanu komoru, Hi-kvadrat testom izračunat će se razlike između proporcija svih imunopozitivnih i imunonegativnih neurona za pojedinu komoru srca. Razina značajnosti određena u cijelom istraživanju je p<0.05.

14. Znanstveni doprinos opisati distribuciju, morfološke i neurokemijske karakteristike aferentnih neurona u spinalnim ganglijima koji se projiciraju u različite dijelove srca štakora pokušat ćemo razlučiti pojedine subpopulacije neurona zaduženih za prijenos osjeta iz morfološki i funkcionalno različitih dijelova srca te će se stvoriti temelji zadaljnja istraživanja usporedbom broja i neurokemijskih karakteristika srčanih osjetnih neurona u spinalnim ganglijima mladih i starih štakora pokušat ćemo rasvijetliti jesu li sve subpopulacije osjetnih neurona u spinalnim ganglijima jednako podložne starenju

15. Rezultati 1: Distribucija spinalnih neurona u DRG-u Figure 1. Distribution of spinal afferent neurons in dorsal root ganglia bilaterally FB labeled neurons are presented as Mean ±SD. LV-left ventricle, RV-right ventricle, LA-left atria, RA-right atria Guić MM, Košta V, Aljinović J, Sapunar D, Grković I.Characterization of spinal afferent neurons projecting to different chambers of the rat heart. Neurosci Lett 2010;469:314-8. Epub 2009 Dec 16

16. Rezultati 1: Neurokemijske karakteristike Figure 2: Neurochemical characterization of heart-projecting neurons in DRGs. Arrow indicates Fast Blue (FB) labeled neuron (A) that exhibits no binding capacity for isolectin B4 (B) but is immunoreactive for neurofilament 200 (C) and another two FB labeled neurons (D) that are isolectin B4 negative (E) but contain calretinin (F). Scale bar = 50µm. Guić MM, Košta V, Aljinović J, Sapunar D, Grković I.Characterization of spinal afferent neurons projecting to different chambers of the rat heart. Neurosci Lett 2010;469:314-8. Epub 2009 Dec 16

17. Rezultati 1: Neurokemijske karakteristike • Nema razlike u proporciji IB4+ neurona među neuronima koji se projiciraju u različite komoresrca štakora. • Značajno veća proporcija N52-pozitivnih neurona projicira se u lijevu stranu srca (LK i LP) u usporedbi s desnom stranom (Hi kvadrat test; p=0.004). • Najveći broj FB-obojanih CALR-pozitivnih neurona je utvrđen u neuronima koji se projiciraju u lijevu pretklijetku u usporedbi sa svim ostalim srčanim komorama (LP vs. LK, 16.7% vs. 3.9%, p<0.01; LP vs. DP, 16.7% vs. 5.6%, p=0.02; LP vs. DK, 16.7% vs. 2.6%, p=0.02, Hi kvadrat testza sve usporedbe).

18. Zaključci Distribucija srčanih spinalnih aferentnih neurona je od T1 do T4, a najviše ih je u T2 Inervacija različitih srčanih komora od strane spinalnih aferentnih neurona je obostrana Neuroni iz različitih srčanih komora su neurokemijski različiti Promjene broja i neurokemijskih karakteristika spinalnih aferentnih neurona koji se projiciraju u različite srčane komore štakora u starosti?

19. Hvala na pažnji!