RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Míriam Onrubia Laura Plaza Patricia Resa

2. Resonancia Magnética Nuclear La RMN es un fenómeno que ocurre cuando el núcleo de ciertos átomos inmersos en un campo magnético estático, son expuestos a un segundo campo magnético. 1H, 13C, 15N, 31P

3. Características RMN • Uso de muestras no cristalizadas  estructura en solución • Posibilidad de aplicar a moléculas sin cristales disponibles. • Amplio rango de condiciones experimentales • PDB: 16% de proteínas determinadas por RMN • Determinación de estructuras de tamaño limitado (35-40 KDa)

4. Mecánica Clásica y Cuántica µ = momento magnético dipolar B = Campo magnético e = carga del e- m = massa del átomo o e- L = Σ momentos angulares γ = cte giromagnética M = magnetización ml = momento angular de spin

5. Mecánica Cuántica Niveles cuánticos de la energía en B0: DE

6. Orientación de los spins B0

7. Nα> Nβ Población de niveles energéticos Frecuencia de Larmor

8. Aplicación de B1 B0 B1

9. Relajación

10. ¶L T = = M x B ¶t ¶M ¶L = γ = γT = γ (M x B) ¶t ¶t Ecuaciones de Bloch

11. Ecuaciones de Bloch Soluciones

12. Representación de las ecuaciones de Bloch

13. Ecuaciones de Bloch Soluciones

14. Relajación T1 T1: longitudinal relaxation time o spin-lattice relaxation time T2: transverse relaxation time o spin-spin relaxation time T2 T1 T2

15. Recoger la señalFree Induction Decay (FID) Señal Función de onda para cada sistema spin Frecuencias Transformada de Fourier

16. RNM unidimensional

17. Determinación estructural de proteínas para RMN Proteínas pequeñas (< 10 kDa) • RMN bidimensional basada en experimentos de 1H • La estructura se puede obtener sin necesidad de enriquecimiento isotópico. Proteínas pequeñas-medianas (< 20 kDa) • Marcaje isotópico (15N i 13C) • Experimentos de RMN multidimensionales (3D) de triple resonancia (1H/13C/15N) Proteínas grandes (> 20 kDa) • Marcaje isotópico (15N i 13C) + deuteración (50%-70% 2H) • Experimentos de RMN multidimensionales (3D i 4D) de triple resonancia (1H/13C/15N) sofisticados

18. RMN bidimensional • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY. • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros • Determinación de las distancias entre Aa • Reconstrucción 3D

19. B0 COSY • Identifica los sistemas de spin característicos de los aminoácidos. • Permite, por tanto, identificar los aminoácidos.

20. C B A HC HC HC HB HB HB HB HC HA HA HA HA CH3-CH2-OH COSY 90º 90º t1 t2 t3 t4 TF 90º 90º TF 90º 90º TF 90º 90º TF

21. Tiempo de evolución (t1) Transformada de Fourier υ COSY

22. t1 t2 t3 t4 1ª transformada de Fourier 2ª transformada de Fourier

23. B0 NOESY • Técnica para correlacionar núcleos en el espacio que se encuentran a una distancia menor de 5Å. • La diferencia entre los espectros con y sin efecto NOE da lugar al espectro NOESY. Cuanto mayor es el efecto menor es la distancia. • Permite la identificación de la posición específica de cada aminoácido en la secuencia.

24. Efecto NOE: Nuclear Overhauser Effect La irradiación sobre un núcleo produce variaciones en la resonancia en los núcleos vecinos. Condiciones: • distancia < 5Å • Saturación de la resonancia

25. RMN bidimensional • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY. • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros • Determinación de las distancias entre Aa • Reconstrucción 3D

26. Asignación Identificar tipos de Aa en COSY y TOCSY Identificar en NOESY los Aa de la secuencia Desplazamientos químicos en COSY

27. Asignación de los sistemas de spin de los Aa

28. Experimento 2D COSY (COrrelation SpectroscopY) Experiment2D TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) O -HN-CH-C- CH γCH3 CH3 CH3 γCH3 Val βH αH NH Asignación de los sistemas de spin de los Aa

29. Asignación de los sistemas de spin de los Aa CHbi O CHbi+1 O Ni Cai Ci Ni+1 Cai+1 Ci+1 Ni+2 H Ha H Ha H picos correlación TOCSY, COSY

30. Asignación de los sistemas de spin de los Aa

31. Experiment 2D NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY) Ala O O -HN-CH-C- -HN-CH-C- CH3 CH gCH3 gCH3 CH3 CH3 Val bH aH bH NH aH NH Asignación de los sistemas de spin de los Aa

32. H-K1-F2-I3-V4-F5-F6-I7-K8-F9-K10-OH 2D COSY 2D TOCSY F F F F I V F Asignación secuencial 2D NOESY K K K K F K I I 8 9 10 3 4 5 V I V F F I K 3 4 5 6 7 8 F I K K F I 6 7 8 1 2 3 H- -OH K F I V F F I K F K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 y al final de la asignación ...

33. RMN bidimensional • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY. • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros • Determinación de las distancias entre Aa • Reconstrucción 3D

34. H H H H H Determinación de las distancias entre Aa NOE  distancias NOEs intensos: 1.8 < rHH < 2.8 Å NOEs medios: 1.8 < rHH < 3.5 Å NOEs débiles: 1.8 < rHH < 5 Å

35. RMN bidimensional • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY. • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros • Determinación de las distancias entre Aa • Reconstrucción 3D

36. Estructura 3D geometría covalente Reconstrucción 3D ángulos diedros puentes disulfuro restricciones experimentales límites de distancias entre 1H Coordenadas De los átomos de la proteína Secuencia proteína Longitudes y ángulos de enlace quiralidad, planaridad Interacciones no covalentes: van der Waals, electrostáticas, enlaces d’H

37. Estructura de proteínas enlace

38. Estructura de proteínas ángulo enlace

39. Estructura de proteínas dihedro ángulo enlace

40. Estructura de proteínas dihedro ángulo enlace van der Waals

41. Estructura de proteínas dihedro ángulo enlace + - electrostático van der Waals

42. Estructura de proteínas dihedro puente de hidrógeno ángulo enlace + - electrostático van der Waals

43. NOE dihedro ángulo enlace Estructura de proteínas puente de hidrógeno + - electrostático van der Waals

45. Fin de la presentación, haga click si tiene dudas

46. Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína • NOE • Constantes de acoplamiento (J) • Desplazamientos químicos (δ) • Velocidades de intercambio H D • Coeficientes de temperatura

47. Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína • NOE: La irradiación sobre un núcleo produce variaciones en la resonancia en los núcleos vecinos. Condiciones: • distancia < 5Å • Saturación de la resonancia para igualar estados alfa y beta. Es el método de elucidación de características estructurales en 3D y estereoquímica, usando RMN junto con información de los acoplamientos escalares spin-spin.

48. Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína • Constantes de acoplamiento spin-spin (J): Las interacciones escalares entre núcleos unidos a través de un pequeño número de enlaces covalentes causan desacoplamiento en las señales de RMN. Dependen de la geometría de los enlaces que unen los spins nucleares.

49. Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína • Desplazamientos químicos (δ): Los diferentes protones de una molécula presentan frecuencias de resonancia característica en función de su entorno químico.

50. Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína • Velocidades de intercambio 1H 2H: 5. Coeficientes de temperatura: permite saber si se forman puentes de hidrógeno intramoleculares.