1 / 38

Mikrobiolo š ki preparati

Mikrobiolo š ki preparati. Mikrobiolo š ki preparati. mikrobiolo š ke preparate pravimo u cilju posmatranja MO (morfologija, struktura, oblik, raspored ć elija, pokretljivost…) Preparat mo ž e da bude: Nativni preparat - posmatranje ž ivih MO Fiksirani preparat. Nativni preparat.

kynthia-rose
Download Presentation

Mikrobiolo š ki preparati

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Mikrobiološki preparati

  2. Mikrobiološki preparati • mikrobiološke preparate pravimo u cilju posmatranja MO (morfologija, struktura, oblik, raspored ćelija, pokretljivost…) • Preparat može da bude: • Nativni preparat - posmatranje živih MO • Fiksirani preparat

  3. Nativni preparat • posmatranje živih MO (pokretljivost) • nedostatak-slaba vidljivost, mogućnost infekcije, jednokratna upotreba • procedura pripreme: • na predmetnicu se stavlja uzorak (u slučaju tečne kulture stavlja se kap suspenzije, u slučaju čvrste podloge u kap fiziološkog rastvora unosi se materijal iz kulture) • pokrovnica • mikroskopiranje

  4. Nativni preparat

  5. Fiksirani preparat • prednosti-višekratna upotreba, ne postoji mogućnost infekcije, posmatranje strukture, oblika i morfologije, ćelije lakše uočljive • procedura pripreme: • nanošenje suspezije na predmetnicu i pravljenje razmaza • sušenje na vazduhu • fiksiranje (provlačenjem kroz plamen) kako bi ubili MO i fiksirali ih za predmetnicu • bojenje preparata • mikroskopiranje

  6. Pravljenje razmaza

  7. Fiksiranje preparata

  8. Bojenje preparata • Prosto bojenje - koristi se 1 boja -uocavanje oblika i rasporeda celija -boje koje se primenjuju: kristal violet, safranin, metilensko plavo… • Slozeno bojenje - koristi se 2 ili vise boje -uocavanje morfologije i strukture celije -tipovi slozenog bojenja: bojenje po Gramm-u, bojenje acido-alkohol rezistentnih bakterija ,bojenje kapsula, bojenje endospora, bojenje nukleinskih kiselina, bojenje flagela

  9. Mikrobiološke boje • organska jedinjenja koja boje odredjene ćelijske strukture • Prema poreklu dele se na: • prirodne: šafranin (šafran), lakmus (lisajevi) • veštačke (anilinske boje) • soli koje prilikom pravljenja vodenih rastvora disosuju: • bazno – katjonske boje (kristal violet, šafranin…) • kiselo – anjonske boje, negativno bojenje (eozin) • neutralno-neutralno crveno

  10. Mikrobiološke boje • Svaka boja mora da sadrži dve grupe: • hromoformnu (nosilac karaktera boje, NO2) • auksohromnu (el. disocijacija, OH¯, NH2)

  11. Prosto bojenje • Procedura: • Pravljenje razmaza • Sušenje (na vazduhu) • Fiksiranje • Bojenje -kristal violetom (na predmetnicu staviti filter hartiju i na nju naneti boju, nakon 1-2 min ukloniti filter hartiju, preparat isprati vodom, osušiti filter hartijom, mikroskopiranje) -šafraninom-postupak je identičan, filter hartiju nije neophodno stavljati na preparat pre bojenja

  12. Procedura prostog bojenja

  13. Preparat-prosto bojenje

  14. Složeno bojenje-bojenje po Gramm-u • 1884. danski histolog Christian Gram razvio metod bojenja u cilju diferencijacije bakterijskih ćelija i nukleusa eukariotskih ćelija • diferencijalna slika (identifikacija Gr+ i Gr- bakterija) • na osnovu razlike u gradji cel. zida Gr+ bakterije boje se ljubičasto, dok se Gr- bakterije boje crveno • metoda se zasniva na sukcesivnoj primeni • kristal violeta (osnovna boja) • lugola (učvršćivač) – rastvor I u KI • etanola (obezbojivač) 70% ili 95% • šafranin (suprotna boja)

  15. Procedura bojenja po Gramm-u • Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i fiksiranja pristupa se proceduri bojenja preparata • bojenje kristal violetom 1-2 min (neophodno je staviti na preparat filter hartiju) • lugol 1-2 min • ispiranje vodom • ispiranje etanolom 5-10 sec • ispiranje vodom • bojenje šafraninom 1-2 min • ispiranje vodom, susenje filter hartijom, mikroskopiranje

  16. Procedura bojenja po Gramm-u

  17. Procedura bojenja po Gramm-u nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i fiksiranja pristupa se proceduri bojenja preparata inicijalno se boje kristal violetom kako Gr+ tako i Gr- bakterije u reakciji kristal violeta i joda obrazuje se nerastvorljivi kompleks Gr+ bakterije imaju deblji mureinski sloj u ćelijskom zidu, nepropustljiv za alkohol i boje se ljubičasto Gr- bakterije imaju tanji peptidoglikanski sloj u ćelijskom zidu, propustljiv za alkohol koji rastvara i izvlači kompleks boje i joda

  18. Razlika u gradji ćelijskog zida Gr+ i Gr- bakterija

  19. Preparat-bojenje po Gramm-u

  20. Sporulacija • neke bakterije tokom rasta, procesom sporogeneze formiraju endospore • rezultat nepovoljnih uslova životne sredine, najčešće u uslovima limitiranosti nutrijentima (C, N najznacajniji) • karakteristike spora: odsustvo metaboličke aktivnosti, rezistentnost prema fizičkim i hemijskim činiocima (t°, UV, boje, hemijska jedinjenja, suša…) zbog prisustva egzosporijuma (proteinski omotač) • u povoljnim uslovima procesom germinacije formira vegetativnu ćeliju • jedna bakterijska celija najčešće formira samo 1 sporu • strukture koje služe za preživljavanje, a ne za razmnožavanje

  21. Sporulacija • rezistentnost na toplotu pripisuje se dehidriranom stanju i kalcijum dipikolinatu • gradja spore: jezgro, zid, korteks, omotač, egzosporijum • proces sporulacije odvija se u najmanje 7 faza • tipovi sporulacije: 1. bacilarni-spora manjeg dijametra od ćelije (terminalno, subterminalno ili centralno postavljena) 2. klostridijalni-spora većeg dijametra od ćelije (centralno ili subterminalno postavljena) 3. plektridijalni-spora većeg dijametra od ćelije (terminalno postavljena)

  22. Faze sporulacije

  23. Bacilarni, klostridijalni i plektridijalni tip sporulacije

  24. Bojenje endospora po Schaeffer-Fulton-u • zbog specifičnih fizičkih i hemijskih karakteristika spore teško usvajaju mikrobiološke boje (uočavaju se kao bezbojne intracelularne tvorevine kod prostog i bojenja po Gramm-u) • zagrevanjem preparata zid spore postaje propustljiv za boju, nepropustljivost zida omogućava da prilikom obezbojavanja alkohol ne prodire u sporu i ona ostaje obojena za razliku od drugih vegetativnih oblika bakterija

  25. Bojenje endospora po Schaeffer-Fulton-u • Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i fiksiranja, pristupa se bojenju preparata • Procedura bojenja: • Bojenje malahitno zelenom bojom (5%) 2min, neophodno je koristiti filter hartiju • Zagrevanje predmetnice na plamenu 3-5min (boja treba da isparava, ali ne da ključa), kada ispari veći deo boje doda se nova količina • Ukloniti filter hartiju i ispirati vodom • Bojenje safraninom 3-5min • Ispiranje vodom, sušenje filter hartijom, mikroskopiranje • Spore se boje zeleno, a vegetativne ćelije crveno

  26. Procedura bojenja endospora

  27. Bojenje acido-alkohol rezistentnih bakterija po Ziehl-Neelsen-u • bakterije koje na svojoj površini imaju voštane materije mogu se lako izdvojiti od drugih bakterija u razmazu • one primaju boju, ali se boja ne može isprati pod dejsvom alkohola i kiselina (acido-alkohol rezistentne) • bakterije bez voštanih materija na površini gube boju tokom ispiranja • acido-alkohol rezistentne bakterije na preparatima imaju crvenu boju, dok sve ostale imaju plavu boju • Acido-alkohol rezistentne bakterije: rod Mycobacterium, rod Nocardia

  28. Procedura bojenja acido-alkohol rezistentnih bakterija • na fiksirani razmaz stavlja se filter hartija preko koje se naliva boja karbol fuksin • predmetnica se blago zagreva iznad plamena tako da boja isparava, ali da ne ključa (topi se voštana ovojnica i omogućava prodiranje boje), kada veći deo boje ispari dodaje se nova količina, postupak se ponavlja u toku 5min • ispiranje vodom • obezbojavanje smešom etilena i kiseline (HCl ili H2SO4) 20-30sec • ispiranje vodom • bojenje metilensko plavim 1-3min • ispiranje vodom, susenje u filter hartiji, mikroskopiranje

  29. Procedura bojenja acido-alkohol rezistentnih bakterija

  30. Negativno bojenje • podrazumeva upotrebu 1 kisele boje • boji se pozadina oko ćelija kako bi se lakše uočile veličina, oblik i organizacija celije • ćelije ostaju ne obojene • bakteriološki razmaz se ne fiksiratoplotom (tačnija predstava oblika i veličine ćelije) • primenjuje se prilikom bojenja spirila i spiroheta, koje običnim postupkom prostog bojenja teže primaju boje

  31. Procedura negativnog bojenja • na predmetnicu se stavlja kap nigrozina (tuša) • bakterijske ćelije se prebacuju u kap nigrozina (ili tuša) • drugom predmetnicom pravi se razmaz, prevlačeći je preko predmetnice sa uzorkom pod uglom od 45°, druga predmetnica se koristi kako bi se napravio tanak film ćelija • razmaz se susi na vazduhu • mikroskopiranje

  32. Procedura negativnog bojenja

  33. Preparat-negativno bojenje

  34. Bojenje kapsula • neke bakterije tokom rasta formiraju kapsulu (glikokaliks) oko ćelije • štiti bakterijsku ćeliju od fizičkih i hemijskih faktora sredine, fagocitoze i predstavlja pomoćnu strukturu prilikom pripajanja ćelije za površinu u njihovoj sredini • kapsula-polisaharidna, redje polipeptidna struktura, faktor patogenosti, uočava se primenom kombinovane tehnike negativnog i prostog bojenja • tehnikom negativnog bojenja boji se pozadina primenom kisele boje (nigrozin, tus, eozin), dok se tehnikom prostog bojenja boje ćelije • razmaz sene fiksira da se ne bi uništila kapsula, pa se ne preporucuje ispiranje vodom ili se to čini krajnje pažljivo da se bakterije ne speru

  35. Bojenje kapsula • da bi se izbegli ovi problemi bakterije se nakon negativnog bojenja mogu fiksirati sa nekoliko kapi metil alkohola • pored ove metode koristi se i metoda bojenja razmaza kristal violetom (1%) 2min, nakon čega se boja spira 20%-im rastvorom Cu2SO4, obojeni razmaz se ne ispira vodom, suši se filter hartijom i mikroskopira, bakterije su obojene tamno ljubičasto, a kapsule plavičasto

  36. Bojenje kapsula

  37. Primeri prostog i slozenih bojenja

More Related