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Biologie Moléculaire des Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM)

Biologie Moléculaire des Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM). Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire OPTION CANCEROLOGIE 29 septembre 2010 L.Mauvieux. Plan du cours. Introduction Mécanismes oncogéniques dans les LAM Translocation et oncogénèse des LAM Epigénétique et LAM

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Biologie Moléculaire des Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM)

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  1. Biologie Moléculaire des Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire OPTION CANCEROLOGIE 29 septembre 2010 L.Mauvieux

  2. Plan du cours • Introduction • Mécanismes oncogéniques dans les LAM • Translocation et oncogénèse des LAM • Epigénétique et LAM • Questions sans réponses…

  3. Introduction Les leucémies aigues myéloblastiques Mécanismes oncogènes des LAM

  4. Différenciation normale Cellule souche Moelle Différenciation lymphoïde Différenciation myéloïde Précurseurs Précurseurs Éléments matures Éléments matures Sang

  5. LEUCEMIES AIGUES Cellule souche Leucémie aiguë lymphoblastique Leucémie aiguë myéloblastique Moelle Différenciation lymphoïde Différenciation myéloïde Précurseurs Précurseurs Sang Éléments matures Éléments matures Éléments immatures Éléments immatures

  6. Leucémies aigues myéloblastiques (LAM) • Définition OMS: expansion clonale de cellules blastiques myéloïdes dans la moelle osseuse, le sang ou autres tissus • Maladies génétiquement et phénotypiquement hétérogènes • Incidence 2 à 3/100000 adultes dans pays industrialisés (maximum US, Australie, Europe de l’ouest) • Age moyen 65 ans, peu fréquent chez les enfants • LAM = cancer = mutations • Maladie hématologique hétérogène: • Morphologiquement • Génétiquement

  7. Maladie hématologique génétiquement hétérogène: • mutations somatiques, clonales de la CSH • Pas de transmission à la descendance (rarissime) • Plusieurs mutations nécessaires, de 3 à 20? • Mutations ponctuelles • Amplifications, délétions • Réarrangements chromosomiques • Nombreux mécanismes oncogéniques découverts= espoir de thérapeutiques spécifiques

  8. TWO-HIT MODEL (Gilliland) • 1) Anomalies génétiques portant sur la prolifération et la survie des progéniteurs • Activation de voies de transduction • Mutations activatrices de: Ras, c-kit, FLT3 • Mutations inhibant NF-1 • Inhibition de la phosphatase hématopoïétique SHP-2 (voie JAK-STAT) • Inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (p15; p16) (méthylation) • identifiées dans 50% des LAM • souvent exclusives les unes des autres

  9. 2) Anomalies agissant sur la différenciation hématopoïétique • impliquant le plus souvent des facteurs de transcription ou des coactivateurs importants pour l’hématopoïèse normale • Core binding factor (CBF) • Récepteur de l’acide rétinoïque • MLL (Trithorax homolog) • =>Coopération des deux groupes pour déclencher la pathologie • Souris transgénique PML-RARA: LAM en 6 mois (15-30%) • Souris transgénique FLT3-ID: lymphome T en 6 mois • Souris reconstituée avec une moelle FLT3-ID + PML-RARA: 100% de pénétrance avec délai raccourci bon pronostic mauvais pronostic

  10. Coopération entre les mutations dans la pathogénèse des LAM Anomales de Type II Anomalies de Type I FLT3-ITD FLT3-TKD KIT RAS PTPN11 JAK2 PML-RARA RUNX1-RUNX1TA CBFB-MYH11 MLL fusions CEBPa NPM1 Avantage prolifératif Altération de la différenciation Et de l’apoptose

  11. Leucémogénèse: processus multi étapes(3) réalité + complexe blocage de différenciation avantage prolifératif CBF RARα Réarr MLL Co activateurs C/EBP bcr-abl TEL-PDGFRβ RAS FLT3 autres TK activées LEUCEMIE AIGUE auto-renouvellement autres… WNT Notch Bmi-1 Hox apoptose? … ?

  12. LAM : Maladie de la cellule souche, multi-étapes • Rares familles avec mutations du gène AML1: leucémie tardive (anomalies chromosomiques supplémentaires dans les cellules hématopoïétiques) • détection de translocations chromosomiques associées aux leucémies in utero [t(4;11)], la pathologie apparaissant plus tard dans la vie • sang de cordon ombilical: transcrits de fusion TEL–AML1 et AML1–ETO 100 fois plus fréquents que la prévalence de la leucémie aiguë correspondante dans la population • Existence de pathologies évoluant progressivement vers la leucémie aigue myélolastique Owen CJ, Blood. 2008 Aug 21

  13. Anomalies géniques • « Bruit » chromosomique (aléatoire)? • Anomalies primaires • précoces • confère le caractère oncogénique • Anomalies secondaires • au cours de l ’évolution de la maladie • influe sur la progression • modifie phénotype tumoral

  14. ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN) Hyperdiploidie 50-65 chromosomes Hypodiploidie 26-34 chromosomes

  15. CONSEQUENCES MOLECULAIRES DESREMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLES

  16. Caryotype (cytogénétique conventionelle)

  17. IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) IGH/CCND1

  18. Peinture chromosomique

  19. Multi-FISH

  20. Gènes impliqués dans les translocations • Ce sont très souvent des facteurs de transcription qui interviennent dans la « maintenance » des CSH et dans l’hématopoïèse précoce (oncogènes) • Cheminement de la découverte des fonctions de ces oncogènes: • 1 - d’abord par la compréhension de la pathologie maligne: les leucémies • 2 - Certaines anomalies chromosomiques récurrentes de ces leucémies • 3 – des modèles animaux modifiés (Tg; KO)

  21. Anomalies chromosomiques = guide • Permet le clonage des gènes responsables • Compréhension de la physiopathologie • Marqueur de clonalité / Facteur pronostic • Cible thérapeutique potentielle • molécule spécifique éventuelle (acide rétinoique) • Adaptation du traitement en fonction de critères pronostics associés aux différentes anomalies

  22. Oncogénèse des LAM: Cibles multiples ●Récepteurs -FLT3 -PML-RARA ●Activation gènes de la différenciation: -AML1 -RARA ●Transduction du signal -Ras ●Facteurs de transcription -AML1, MYH11 -ETV6 (TEL) -MLL… Modification épigénétiques ADN, histones, miRNA ●Cycle cellulaire -p27 -p15 Noyau Surveillance intégrité ADN p53

  23. LAM et translocations chromosomiques • Elles sont réciproques, stables et équilibrées • Entraînent la fabrication d’un transcrit de fusion et d’une protéine chimérique avec de nouvelles propriétés qui va interférer avec la maturation myéloide • récurrentes • Particularité: dans les LAM qui apparaissent après un traitement avec des agents alkylants, s’accompagnent de délétions de chromosomes 5 et 7

  24. Mécanismes oncogènes principaux dans les LAM • Peu de mutations prédisposantes transmissibles ont été trouvées • Translocations chromosomiques réciproques nombreuses: • Découverte des gènes impliqués • Cassures de l’ADN: au hasard? • Rôle de la structure chromatinienne: • « accessibilité » • Sites sensibles spécifiques: • ADN topoisomérases • Sites hypersensibles à la DNase • Séquences Alu • Mutations de gènes (FLT3, NPM1), fréquentes en l’absence de translocations • Classification des LAM (OMS, 2001, 2008) • Distingue les LAM avec anomalies chromosomiques récurrentes des autres

  25. Analyse génomique du locus 11q23 (gène MLL) • Impliqué dans 15% des LAM • > 70 translocations, >50 gènes partenaires différents décrits • Dans la très grande majorité corrélée à un mauvais pronostic de la maladie

  26. MLL (Mixed lineage leukemia) SET Zn-finger Bromo Zn-finger FY SLN TAD • 2 domaines de fixation à l’ADN • 1 domaine méthyl-transférasse • Un bromodomaine (fixation protéines) • 1 domaine de transactivation (fixation CBP, activation HOX) • 1 domaine de type SET (homologies trithorax drosophile+++) • Activité methyltransferase , notamment sur gènes HOX cruciaux pour le développement ADN chromatine CBP méthylation chromatine

  27. 1-Analyse génomique des points de cassure des translocations (1) • Les points de cassure ne sont pas distribués au hasard dans le gène • Situés sur des « clusters » introniques (BCRs) • Des biais de localisation ont été montrés: • BCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulte • Entre des leucémies de novo et secondaires à un traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie • => mécanismes probablement différents!!!

  28. BCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulte • Entre des leucémies de novo et secondaires à un traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie • => mécanismes probablement différents!!!

  29. 2-Analyse des séquences nucléotidiques aux points de cassure des translocations • Séquences aux points de cassure: très peu d’homologie de séquence (parfois séquences Alu- discuté) • Les points de cassure colocalisent avec des éléments de la structure chromatinienne: • Sites de clivage de la topoisomérases II • Sites hypersensibles à la DNase 1 • SARs (scaffold attachment régions) => impliquées dans la survenue des translocations

  30. MLL, topoisomérases et translocations • La topoisomérase II catalyse la relaxation des doubles brins d’ADN : • « Nick » de 4 bases au niveau de son site de fixation • Permet le passage d’une seconde hélice d’ADN • Réparation de l’ADN • Essentielle dans: • Condensation chromatinienne • Transcription, réplication, apoptose… • Drogues inhibant la topoisomérase • Stabilisation du complexe de clivage (poison) • Inhibition catalytique de l’enzyme • Aliments contiennent des éléments interagissant avec la topoII (flavonoïdes, caféine, phénols des plantes): • Ex: café, pommes, oignons, soja, fruits rouges, thé, chocolat…

  31. Modèle de lésions induites par l’ADN topoisomérase II dans la survenue de translocation impliquant MLL Gilliland, D. G. et al. Hematology;2004:80-97

  32. Gene MLL – chromosome 11q23 BamH1

  33. Sites sensibles à la topoisomérase II dans t(4;11) Lovett, Brian D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9802-9807 Autoradiographs of cleavage products after 10 min incubation of 25 ng (30 000 c.p.m.) singly 5' end-labeled DNA with 147 nM human DNA topoisomerase II      

  34. Sites sensibles à la topoisomérase II dans t(9;11) Ryan J Whitmarsh et al. Oncogene (2003) 22, 8448–8459

  35. Éléments chromatiniens impliqués dans les translocations • Beaucoup de sites HS Dnase sont associés avec: • Éléments génomiques régulateurs de la transcription • SARS • Les SARS définissent les sites d’attachement dans la matrice nucléaire des boucles de l’ADN pendant l’interphase ou la métaphase • Zones de fragilité liée au propriétés de déroulement de l’ADN de certaines des protéines qui les composent

  36. 2ième exemple:Facteurs de transcription : CBFs (core binding factors) et LAM Facteur de transcription dimérique: -CBFa: AML1 (RUNX1) -CBFb: MYH11

  37. 1) Core binding factors (CBFs) dans les LAM • CBF est un facteur de transcription hétérodimérique constitué de: • CBFa =AML1 = RUNX1 (21q22.3) • CBFb (16q22.1) • Rôle majeur dans l’hématopoïèse: • Impliqués dans des translocations récurrentes des LAM: • t(8;21)(q22;q22)  ETO-AML1 (10 à 15% des LAM) • t(3;21)(q26;q22)  AML1-EVI1 (<1%) • inv16(p11;q22)  CBFb-MYH11 (10% des LAM) • Sans compter t(12;21) TEL-AML1 dans 30% des LAL de l’enfant • Mutations ponctuelles de AML1

  38. Conséquences des anomalies CBF • Souris KO CBFb ou AML1: • mort à J11.5 du développement • pas d’hématopoïèse définitive • Ces trois translocations inhibent la fonction normale de CBF, les transcrits chimériques pouvant: • Recruter des hitones déacétylases (HDAC) • Des co-represseurs (NCOR1, NCOR2, Sin3A • En recrutant des méthyl transférases • Souris Transgénique AML1-ETO: effet « immortalisant » des progéniteurs • Anomalies des CBFs associées à un pronostic favorable

  39. Localisation des points de cassure dans RUNX1/AML1 • 35 patients avec t(8;21)- AML1 -ETO: point de cassure génomique dans l’intron 5 • 10 patients avec t(3;21) – AML1-EVI1: introns 5 et 7a • TEL-AML1 : leucémies aiguës lymphoblastiques: point de cassure différent

  40. Sites sensibles topoII - DNase gène AML1 • Colocalisation des points de cassure • Les sites topoisomérase II • les sites hypersensibles à la Dnase I… Yanming Zhang, Janet D. Rowley. dna repair 5 ( 2 0 0 6 ) 1282–1297

  41. Niveau d’énergie libre ADN du gène AML1 …colocalisation des points de cassure avec le niveau d’énergie libre nécessaire pour dérouler l’ADN super-enroulé

  42. Les zones d’énergie libre faible colocalisent avec les points de cassure dans: • AML1, ETO • mais aussi montré pour BCR, ABL, MLL • Les sites de clivage topoII et l’energie libre les plus faibles sont probablement des sites vulnérables pour les cassures, réparées ensuite par des mécanismes de réparation « non homologue » (NHEJ: non-homologous end-joining)

  43. Oncogénèse des LAM etLigands des récepteurs aux hormones L’histoire d’un succès thérapeutique

  44. Léucémies aigues promyélocytaires • Translocations récurrentes du chr 17q21dans 5-8% des LAM • Arrêt de maturation au stade promyélocytaire • cassure dans le gène du récepteur à l’acide rétinoïque (RARA • Les ligands de ce récepteur ont un rôle fondamental dans la différenciation de la lignée granuleuse

  45. récepteur nucléaire de l’acide rétinoïque liaison à l’ADN (RARE) après hétérodimérisation avec un autre récepteur nucléaire RXR FT°, régulateur transcriptionnel « hormone-inductible » régulation de gènes cibles en présence d’AR rôle dans la maturation myéloïde Structure et fonction des protéines partenaires 1- RAR (17q21) 5’-AGGTCA (N)5 AGGTCA-3’ 3’-TCCAGT (N)5 TCCAGT-5’ activation transcriptionnelle AF-1 inconnu Coiled-coil domain A B C D E F Liaison ADN Fixation ligand Hétérodimérisation Activation transcriptionnelle AF-2 Liaison co-Act, co-R

  46. - dimérisation RAR-RXR SMRT • fixation sur seq régulatrices (RE) de gènes cibles • - intervention de corépresseurs Ncor et SMRT qui recrutent des histones desacétylases (HDAC) DEACETYLATION HDAC REPRESSION de la TRANSCRIPTION (compaction chromatine) R X R R A R RARE Fonction physiologique de RAR(en absence d’acide rétinoïque)

  47. - AR: liaison à RARα  détachement des corépresseurs et le recrutement de coactivateurs (SRC1, CBP) SMRT • - Recrutement d’ histones acétyltransférases (HAT) ACTIVATION de la TRANSCRIPTION (ouverture chromatine) ACETYLATION HAT SRC-1 Ac R X R R A R Ac. Rétinoïque (doses physiologiques) Ac RARE Ac Fonction physiologique de RAR(en présenced’acide rétinoïque) DIFFERENCIATION MYELOIDE

  48. 2- PML (15q22) • fonctions mal connues • effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques • => contrôle de la prolifération et de la survie cellulaire • localisation nucléoplasmique et corps nucléaires ( association à d’autres protéines : CBP, Daxx, ..) • CBP: favorise acétylation des histones activ° transcription l’interaction CBP-PML peut expliquer les effets modulateurs de PML sur la transcription • - Daxx : voie apoptotique • - PML-/-: aN de la différenciation • domaine de dimérisation

  49. D- Protéine de fusion X-RAR PML (15q22) Promyelocytic Leukemia RAR (17q21) PLZF (11q23) Promyelocytic Leukemia Zinc Finger NMP (5q35) Nucleophosmine N/RAR NuMA (11q13) Nuclear Matrix Associated fig. 3

  50. B C D E F Protéine de fusion PML-RAR 1- structure Maintien des domaines importants de chacun des partenaires: - PML: motif RBCC (homodimérisation et interaction protéine-protéine) - RAR: fixation ADN, activation transcription en présence ligand, hétérodimérisation RXR RAR PML bcr 1 (L type) 3 4 5 6 3 bcr 2 (V type) 3 3 4 5 6 bcr 3 (S type) 3 3 3 transcripts majeurs PML/RAR

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