Иммунологические маркеры развития перинатальных инфекций

1. Иммунологические маркеры развития перинатальных инфекций Долгих Т.И., Шелев М.В., Тирская Ю.И., Белкова Т.Н.

2. Инфекционная перинатальная патология • За последние 7 лет в г. Омске: • Отмечается рост перинатальных потерь с увеличением доли инфекций в их структуре (увеличение показателя несостоявшегося выкидыша с 7,3 до 8,8 на 100 родов) • Отмечается высокий уровень антенатальной смертности (среднемноголетний показатель 4,9 на 1000 родившихся живыми и мертвыми). • На фоне снижения младенческой смертности остается высокой младенческая заболеваемость. Отмечается выраженный рост заболеваемости внутриутробными инфекциями доношенных новорожденных (Тпр.=9,0%; р<0,05). • Возросла частота случаев задержки внутриутробного развития плода (ЗВУР) . • В формирование перинатальной патологии значительный вклад вносят герпесвирусы с повышением значимости ВЭБ, ВГЧ 6 типа, вирусно-бактериальных ассоциаций.

3. Инфекционная перинатальная патология • Преобладание малосимптомного течения перинатальной инфекции осложняет постановку диагноза. • Продолжается поиск эффективных маркеров реализации внутриутробной инфекции у плода и новорожденного • Необходимо разработать методологическую основу регионально ориентированной программы эпидемиологического мониторинга за инфекционной перинатальной патологией. • Целесообразна разработка тактики ведения женщины и новорожденного на основе персонифицированного подхода к мониторингу и терапии. • Цель: разработка диагностических и прогностических критериев развития внутриутробной инфекции для оптимизации диагностики и лечения женщин и новорожденных с данной патологией

4. Консенсус между специалистами по вопросам диагностики: как его достичь? 1. Работать вместе над решением клинических задач; 2. Знать и рационально использовать потенциал лаборатории. Клиницисту надо решить: что исследовать, для чего и каким методом? КАЖДОМУ ТЕСТУ – СВОЕ МЕСТО! Медицинской сестре и лаборанту – обеспечить преналитическйи этап Специалисту КДЛ – предложить оптимальный алгоритм, обеспечить достоверность и быстроту выполнения анализа, оказать помощь в интерпретации результатов

5. Фенотипирование клеток Возможности лаборатории • Использование микробиологических методов: - Бактериологический посев на микрофлору - Бакпосев на грибы с определением чувствительности • Внедрение новых лабораторных технологий: - ПЦР, ИФА, РИФ, в т.ч. на основе биочипов • Иммунохимические метод - Иммуноблот (Line-blot) • Широкое внедрение бесприборных методов диагностики • Возможность одновременной и оперативной комплексной диагностики группы инфекций • Оценка иммунорезистентности с помощью проточной цитометрии и уровня цитокинов

7. Степень активации клеточного иммунитета Степень активации клеточного иммунитета HLA-DR – активация иммунных клеток. Возможные комбинации: CD3+/ HLA-DR, CD4+/ HLA-DR, CD8+/ HLA-DR, CD14+/ HLA-DR, CD5+/19+/HLA-DR

8. Герпесвирусные инфекции:лабораторная диагностика Исследуемый материал Метод Назначение метода Этиологическая расшифровка HSV-1\2-, CMV-, EBV-, HHV-6 -инфекций • - Соскобы из очагаинфекции(глаза, зев, уретра, цервикальныйканал, кожные покровы) • -Лейкоцитарная взвесь • Ликвор(при поражении мозга) • Ткани элиминированныхплодов • Плацента • _________________________ • Сыворотка крови (ИФА, ИБ) ДетекцияДНК вирусов ПЦР Выявлениеантигенов Вирусов РИФ • IgM, IgG, ИА- IgG • IgA (!) • Антителак белкам вируса (ИБ) • В ликвореIgG(LSQ/CSQ) ИФА Иммуноблот

9. Токсоплазмоз (лабораторная диагностика) Исследуемый материал Назначение метода Метод Этиологическая расшифровка ПЦР или РИФ Кровь,ликвор, биоптаты, ткани погибших плодов, плацента Детекция ДНК /антигенов ИФА, Иммуноблот (фазы I, II, III,IV) • Выявление антител: -IgM,IgA,IgG • IgGнизкоавидные • -IgA и IgG-avidity к ROP1, MAG1, GRA7,GRA8,SAG1 ИФА(ликвор) • IgG • LSQ/CSQ=IgG/(ликвор) / IgG(сыворотка) (>1,5 !)

10. Заболевание вызывает яркие высыпания на коже (краснухоподобный синдром) и артропатии,, анемию и апластический криз. Трансплацентарная передача возможна в 33% случаев формирует многоводие, водянку плода, тяжелые анемии, поражение миокарда. Возможна внутриутробная гибель плода(в 25% случаев) Может приводить к прогрессирующей гидроцефалии (из ликвора выделяется ДНК парвовируса В19) (журнал «Детские инфекции», 2010. - № 4). Парвовирусная инфекция В19 • Парвовирус В19 – это малого размера ДНК вирус, который быстро размножается и в основном поражает незрелые формы эритроцитов. • Исследуемый материал – кровь, ликвор. Основные методы – ПЦР и ИФА

11. Объем исследований I . Исследование плаценты женщин, родивших детей с ВУИ (n=598) II . Исследование тканей погибших эмбрионов/плодов (n=746) III. Комплексное поэтапное обследование женщин с внутриутробной гибелью плода IV. Обследование женщин с преэклампсией различной степени тяжести с наличием инфекции (n=115) V . Обследование новорожденных с ВУИ и гипоксией мозга (n=104) V I. Обследование пар «мать-ребенок» (n=302)

12. Женщины, родившие детей с ВУИ: результаты исследования плаценты (ПЦР; %)

13. Внутриутробная гибель плода В формировании патологии плодав I триместре беременности установлена наиболее важная роль принадлежит бактериальной микрофлоры(Staph., E.coli),во II триместре– U.urealyticum(в виде микст-инфекции),в III триместре – вирусам. Listeriaвстречается с частотой17% и 20% при гибели плодав I и во II триместрах. ВоII триместре микст-инфекция вызывает гибель плодав 60,05% случаев (в 1,6 раза чаще, чем вI триместре). Установлена роль вирусов:EBV (22,5% и 16,7%), CMV (16,2% и 13,5), HSV-1/2 (12,3% и 10,3%), Rotavirus (28,5% и 15,6%), Rubella (14,6% и 9,8%), PV B19 (3,2% и 9,5%) – в I и во IIтриместрах ДНК T.gondii обнаруженав 12,4% и в 17,5%.

14. Женщины с внутриутробной гибелью плода 1 этап – оказание неотложной помощи и установление факторов риска* (стационар): • Прогностические критерии развития системной воспалительной реакции: • снижение уровня РАИЛ, ИЛ-10 и бактерицидного гуморального фактора лактоферрина (при вирусной и вирусно-бактериальной инфекции) при неизмененном уровне провоспалительных цитокинов - ФНО-α и ИЛ-1β. • Повышение концентрации РАИЛ в течение первых суток после элиминации погибшего эмбриона/плода является критерием гнойно-воспалительного поражения плодного яйца и децидуальной ткани, что требует проведения адекватной стандартной терапии с учетом биотопа половых путей женщины. __________________________________________ * - Утверждена медицинская технология

15. Женщины с внутриутробной гибелью плода 1 этап – оказание неотложной помощи и установление факторов риска* (продолжение): • наличие мертвого плода 5 недель и более (ведущий фактор); • наличие вирусно-бактериальной или бактериальной инфекции; • повышенное содержание D-димера и гомоцистеина. • Разработана тактика ведения женщин, основанная на применении неинвазивных методов удаления внутриутробно погибших плодов с использованием препаратов (простагландин Е2 и F2α), что позволило снизить количество органоуносящих операций в 5 раз и предотвратить материнскую смертность • __________________________________________________

16. Клинико-лабораторный мониторинг и прегравидарная подготовка • 2 этап (амбулаторно-поликлинический) • Выявление причинно-факторных связей у женщин с невынашиванием. • Расширенная этиологическая расшифровка. • Клинико-лабораторный мониторинг с оценкой системы гемостаза и определением полиморфизмов генов системы гемостаза и врожденного иммунитета. • Оценка интерфероновой системы (при герпесвирусных инфекциях) • Коррекция нарушений и адекватная прегравидарная подготовка. • Результаты: • Привело к снижению преждевременного прерывания беременности в 3,7 раза (до 18,7%), антенатальной гибели плода –в 79 раз (до 0,8%). • _________________________________ • * - Утверждена медицинская технология «Тактика ведения беременных с синдромом потери плода (клинико-лабораторное обоснование)»

17. VI.Иммунологические факторы при преэклампсии • При обследовании 115 беременных с преэклампсией установлено наличие достоверной прямой связи уровня провоспалительного цитокина TNF-αи IFN-γ: • со степенью тяжести преэклампсии (r = 0,38 и r = 0,46 соответственно); • с уровнем панкреатической амилазы (r = 0,35 и r = 0,53 соответственно); • с уровнем панкреатической липазы (r = 0,37 для TNF-α); • с уровнем D-димеров (r = 0,37 и r = 0,41 соответственно); • с активностью АЛТ и АСТ (r = 0,39, r = 0,37 и r = 0,59, r = 0,43 соответственно). • При вирусно-бактериальной микст-инфекции имеются более выраженные нарушения со стороны цитокиновой системы, системы гемостаза, печени и поджелудочной железы

18. Дополнительные лабораторные тесты при преэклампсии Резюме: 1. Одним из факторов, способствующих усугублению преэклампсии, является повреждение поджелудочной железы за счет усиления процессов перекисного окисления липидов и оксидативного стресса, что может быть обусловлено падением антиоксидантной защиты. 2. Усугублению панкреатической дисфункции и, возможно, панкреатита с ферментативной токсемией, по-видимому, способствует и сдвиг продукции цитокинов в сторону провоспалительных. 3. У беременных с тяжелой степенью уровеньTNF-αи IFN-γимеет достоверную связь с основными клинико-лабораторными показателями и уровнем панкреатической амилазы и липазы на фоне снижения антиоксидантной защиты

19. IV. Женщины, родившие детей с ВУИ • Состояние иммунной системы женщин данной группы характеризовалось: • достоверным повышением содержания лимфоцитов с фенотипом CD3+/ CD16+ CD56+, CD3+/CD4+и снижением CD3+/CD8+ • Высокий уровень Т-NK отмечался у женщин при гематогенном пути инфицирования герпевирусами • Повышением уровня провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1β) • Снижением уровня противовоспалительных цитокинов (IL-10)

20. V. Реализация ВУИ у новорожденных • Доказано наличие напряженности иммунитета у детей с верифицированной инфекцией уже в периоде внутриутробного развития, причем развитие иммунного ответа формируется в основном за счет компонентов врожденного иммунитета – цитокинов. • Наиболее значимыми критериями реализации внутриутробной инфекции у новорожденных независимо от срока гестации являетсяуровень активированных моноцитов и хемокина интерлейкина-8.

21. Уровень цитокинов в плазме крови новорожденных с ВУИ (2А) и новорожденных с перинатальным поражением мозга гипоксического генеза (2Б), пг/мл

22. Распределение лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против СD14 и CDHLA-DR, меченых FITC и PE, в группах 1А и 1Б (%).

23. VI. Стратификация риска развития ВУИ • Включает оценку прогностических факторов: • 1. Осложненный акушерско-гинекологический анамнез: • самопроизвольные аборты, • неразвивающаяся беременность, • рождение детей с врожденными аномалиями или ВУИ, • преждевременные роды, • перинатальная гибель плода. • 2. Наличие очагов экстрагенитальной инфекции: • мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит, цистит). • 3. Наличие вирусно-бактериальной инфекции и активной герпесвирусной инфекции. • 4. Осложненное течение гестационного процесса: • рецидивирующая угроза прерывания беременности, • воспалительные заболевания нижнего отдела гениталий, • наличие хориоамнионита в родах

24. Стратификация риска развития ВУИ (продолжение) • Ультразвуковые маркеры ВУИ : • задержка развития плода в сочетании с изменением количества околоплодных вод, • множественные кальцинаты плаценты, • утолщение плаценты, • взвесь в околоплодных водах, • нарушение плодово-плацентарного кровотока, • многоводие/маловодие. • 5. Иммунологические маркеры реализации ВУИ : • Повышение провоспалительных цитокинов (IL–1β, ФНО, IL–8, IL–6), • Снижение продукции противовоспалительного цитокина IL–10, IFN-γ • 6. Предикторы развития осложнений при беременности : • Нарушения в системе гемостаза • Повышение уровня цитокинов (IL–1β, ФНО, IL–8) и лактоферрина, • Снижение продукции противовоспалительного цитокина IL–10 и IFN-γ • Повреждение поджелудочной железы (ферментемия) • ВЫВОД: • Наиболее значимыми критериями развития ВУИ (p*16<-0.05) являются: • бактериальный вагиноз + воспалительные заболевания органов малого таза; • утолщение плаценты + синдром задержки развития плода; • вирусно-бактериальная микст-инфекция; • повышение IL–1β >19,25 pg/ml и ФНО > 24,35 pg/ml.

25. Установлены маркеры риска развития ВУИ(данные по программе R_MED) Количественные: Т-лимф CD3+ p=0.052 Среднее: 64.45, 69.570 C Т-хел CD3+ CD4+ p=0.001 Среднее: 28.323, 37.558 M-У Молекулы адгезии p=0.019 Среднее: 51.85, 66.1 C ИРИ p=0.001 Среднее: 0.9483, 1.4929 M-У IgG p=0.043 Среднее: 9.95, 13.333 M-У ИЛ-10 p=0.065 Среднее: 2.2115, 5.3538 M-У ИЛ-1βр=0.0019 Среднее: 507, 229 М-У ИЛ-8 р=0,003 Среднее: 64.4, 52.5 М-У ФНО р=0,001 Среднее: 61.1, 47.2 М-У Категориальные: • "p= 0.080 • Методыстатистического анализа: • построение «дерева решений»: • линейного дискриминантного анализа 3. метода опорных векторов Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 2011614225 «Статистический анализ клинико-лабораторных данных для прогнозирования риска развития патологии (R_MED)»

26. С помощью прогностической таблицы рассчитывается риск ВУИ в баллах Менее 13 баллов: низкий риск Более 13 баллов – высокий риск Исследование содержания цитокинов IL-1β, ФНО Низкий риск: ФНО<24,35 pg/ml; IL-1β<19,25 pg/ml Высокий риск (ФНО>24,35 pg/ml ; IL-1β>19,25 pg/ml ) Расширенный спектр лабораторных исследований для верификации возможных патогенов Профилактика плацентарной недостаточности При верификации возбудителя этиотропное лечение, профилактика ПН При отсутствии возбудителя: профилактика ПН Здоровый ребенок Внутриутробное инфицирование ВУИ Здоровый ребенок

27. Алгоритм ведения недоношенных новорожденных (из группы высокого риска по ВУИ) оценка уровня цитокинов в первые сутки после рождения (IL-8; IL-1β; лактоферрин) IL-8: ↑34,92 pg/ml IL-8: ↓34,92 pg/ml отсутствие ВУИ IL-1β Лактоферрин Лактоферрин: ↑346,6 нг/л риск инфицирования новорожденного Лактоферрин: ↓346,6 нг/л риск ВУИ IL-1β: ↓4,1 pg/ml риск ВУИ IL-1β: ↑4,1 pg/ml риск инфицирования новорожденного этиологическая верификация этиотропное лечение динамическое наблюдение динамическое наблюдение

28. Алгоритм ведения доношенных новорожденных (из группы высокого риска по ВУИ) оценка уровня цитокинов в первые сутки после рождения (IL-8; ФНО) IL-8: ↑25,57 pg/ml ВУИ IL-8: ↓25,57 pg/ml IL-8:5,69-25,57 pg/ml этиологическая верификация этиотропное лечение IL-8: ↓5,69 pg/ml отсутствие ВУИ ФНО ФНО: ↑14,37 pg/ml риск инфицирования новорожденного ФНО: ↓14,37 pg/ml отсутствие ВУИ динамическое наблюдение

29. Благодарю завнимание ! • Для контактов: 644001,г.Омск, 20 лет РККА, д.15. • Телефон: 8(3812)36-23-11, 37-03-55, 37-03-43 • E-mail: dolgih-ti@mail.ru