Analytische Ultrazentrifugation (AUZ)

1. Methodenseminar, Januar 2007 Analytische Ultrazentrifugation(AUZ) Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue

2. Gliederung • Aufbau der Analytischen Ultrazentrifuge • Sedimentationslauf (Sedimentationsgeschwindigkeitslauf) • Gleichgewichtslauf (Sedimentationsgleichgewichtslauf)

3. Fragestellung • Homogenität der Probe (Sedimentationslauf) • Sedimentationskoeffizient (Sedimentationslauf) • Molekulargewicht (Gleichgewichtslauf)

4. Analytische Ultrazentrifuge (AUZ) max. 50 000 rpm Probe: 450 µl AUZ: 160 000€; Rotor: 18 000€; Zelle ca. 2 500€

5. Optische Systeme Probenkonzentration /-verteilung kann während des Laufes verfolgt werden Absorptionsoptik + Wellenlänge frei wählbar (190-800 nm) Probe muss Chromophor sein OD()= 0.5-1.5 Interferenzoptik Laser 675 nm + Probe muss kein Chromophor sein Unterschiedliche Brechungsindizes (Probe und Lösungsmittel) Geringere Empfindlichkeit -> höhere Proteinkonzentration (mind. 1mg/ml) + Schlierenoptik

6. Analytische Ultrazentrifuge (AUZ) Aufhängung Rotor Schlitten Absorption Linsensystem Interferenz Aufhängung Optik Radiometer

7. Strahlengang

8. Sedimentation Wirkende Kräfte Experiment Auswertung Van Holde Weischet Analyse

9. Sedimentation Wie setzt sich der Sedimentationskoeffizient zusammen?

10. Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft • Fz ist dem Schwerefeld proportional • Fz nimmt im Verlauf der Sedimentation zu mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel zu Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit

11. Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft • Fb wirkt Fz entgegen • abhängig von Lösungsmittel mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens

12. Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Ff = Reibungskraft • Ff wirkt Fz entgegen • f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation des Partikels • Zwischen den drei Kräften stellt sich ein Gleichgewicht ein (< 1 ms) mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizient k = Boltzmann Konstante T = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

13. Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Ff = Reibungskraft mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizient k = Boltzmann Konstante T = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

14. Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Ff = Reibungskraft Einheit: = 1 S [Svedberg] mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizient k = Boltzmann Konstante T = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

15. Sedimentation Welche Informationen liefert das Sedimentationsexperiment ?

16. Sedimentationsexperiment mögliche Erkenntnisse • Bestimmung des/der Sedimentationskoeffizienten s • Aussage über Zusammensetzung bzw. Reinheit der Probe (homogen, heterogen) • Aussage über die partielle Konzentration der einzelnen Komponenten

17. Sedimentationsexperiment Vorab: Überlegungen • In welchem Puffer soll Protein/Partikel gelöst sein ? • z.B.: TRIS absorbiert bei 205 nm sehr stark, Phosphatpuffer nicht • Bei welchen Wellenlängen möchte ich messen ? • z.B.: 280 nm → aromatische AS, 205 nm → Peptidrückgrad • Bei welcher Geschwindigkeit soll gemessen werden ? abhängig von MW; so hoch wie möglich, um die Diffusion an der Sedimentationsfront zu minimieren, ABER: es werden für eine gute Auswertung mind. 15-20 Scans für benötigt; im Zweifel mehrere Läufe bei unterschiedl. Geschwindigkeiten • Wie viele Scans in welchem zeitlichen Abstand? so viele Scans wie möglich über die komplette Probenzelle in kurzem zeitlichen Abstand

18. Sedimentationsexperiment Vorbereitungen Reference = Lösungsmittel, 420 µl Sample = Probe in Lösungsmittel, 400 µl - unterschiedliche Befüllung wichtig für Messung der Menisken - sektorförmige Messzelle vermeidet Konvektionen Doppelsektorzelle Zelle zusammenbauen, befüllen und in Rotor einsetzen Rotor in Zentrifuge einsetzen, Optik einschrauben Zentrifuge starten und Vakuum ziehen lassen mind. 30 min bei geringer Geschwindigkeit (ca. 3000 rpm) einlaufen lassen, um konstante Temperatur zu erreichen Experiment starten Dauer: ca. 3 – 4 h

19. Sedimentationslauf Rohdaten Probe Lösemittel radiale Verdünnung durch sektorförmige Messzelle rm = Radius Meniskus rbnd= boundary (Wendestelle der Sedimentationsfront) rb = Radius Boden

20. Auswertung Programm: Ultrascan • Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) • Editieren des Rohdatensatzes • (Anzeige der Menisken und des Plateaus)

21. Auswertung Programm: Ultrascan • Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) • Editieren des Rohdatensatzes • (Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen)

22. Auswertung Programm: Ultrascan • Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) • Editieren des Rohdatensatzes • (Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen) • Auswertung der bearbeiten Daten mit der Enhanced Van Holde-Weischet Analyse (vHWA)

23. Auswertung vHWA Noch mal ein bisschen Theorie: Die Van Holde Weischet Analyse (vHWA)

24. Auswertung Warum vHWA? Warum van Holde Weischet? • korrigiert für Diffusionseffekte • Möglichkeit der besseren Auswertung von heterogenen Proben und Proben mit zwei oder mehr gut voneinander getrennten Komponenten • Auswertung von Datenpunkten in Zell-Bodennähe und von Scans ohne stabiles Plateau möglich

25. Auswertung vHWA Verbreiterung der Sedimentationsfront (Boundary Spreading) : Diffusion vs. Heterogentiät • Partikel unterliegt im Zentrifugalfeld ungerichteter und gerichteter Diffusion • Ungerichtet: BROWNsche Molekularbewegung • Gerichtet/wechselseitig: Konzentrationsgefälle an der Sedimentationsfront • führt zu einer Verbreiterung der Sedimentationsfront = Vortäuschung breiter S-Verteilung; allerdings überwiegt mit vorschreitender Zeit die Sedimentation die Diffusion

26. Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Probe mit nur einer einzigen sedimentierenden Komponente

27. Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Probe mit mehreren Komponenten

28. Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität

29. Auswertung vHWA Berechnung der apperenten Sedimentationskoeffizienten

30. Auswertung vHWA Extrapolationsplot

31. Auswertung vHWA Distributionsplot

32. Auswertung vHWA: Originaldaten

33. Gleichgewichtslauf am Beispiel eines Einkomponentensystems

34. Gleichgewichtslauf 3x identische Probe 100µl Lösungsmittelmeniskus Probenmeniskus 3x identischer Puffer 120 µl Konzentrationsreihe

35. Gleichgewichtslauf Diffusion Sedimentation 0 h 6 000 rpm 8 000 rpm 10 000 rpm Im Gleichgewicht kein netto-Stofftransport

36. Gleichgewicht ist abhängig von… Diffusion Sedimentation • Molekulargewicht • Pufferviskosität • Länge der Flüssigkeitssäule • Temperatur • Winkelgeschwindigkeit Meniskus: darf kein Protein enthalten, Aber auch keine vollständige Sedimentation!

37. Gleichgewichtslauf MP =Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)]ρLM = Lösemitteldichte T = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration

38. Gleichgewichtslauf- lineare Auswertung Ergebnis: 147 - 377 kDa MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)]ρLM = Lösemitteldichte T = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration

39. Gleichgewichtslauf- Global Fit = Parameter können „freigegeben“ werden MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)]ρLM = Lösemitteldichte T = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachse c(r) = Konzentration am Punkt r A = Amplitude B = Baseline

40. Gleichgewichtslauf- Global Fit

41. Gleichgewichtslauf- Global Fit

42. Zusammenfassung • Gleichgewichtslauf: • stationärer Zustand => Molekulargewicht mit hoher Genauigkeit • Sedimentationslauf: • Informationen über Sedimentationskoeffizient, Reinheit und Zusammensetzung der Probe

43. Vorteile • Hydrodynamische Methode: Proteine in Lösung; kein Kontakt mit Trägermaterialien • Gemische können analysiert werden • Kein/kaum Probenverlust • Absolutmethode: keine Kalibrierung • Masse • Größe • Dichte

44. Literatur www.beckmancoulter.com www.nanolytics.de Software http://www.ultrascan.uthscsa.edu/