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« Actualités ( commentées…) du Diagnostic Virologique »

« Actualités ( commentées…) du Diagnostic Virologique ». Patrice Morand Laboratoire de Virologie Faculté de Médecine-CHU Grenoble DU Antibiologie Grenoble 200 7. Y a t-il du nouveau en Sérologie ? Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?.

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  1. « Actualités ( commentées…)du Diagnostic Virologique » Patrice Morand Laboratoire de Virologie Faculté de Médecine-CHU Grenoble DU Antibiologie Grenoble 2007

  2. Y a t-il du nouveau en Sérologie ? • Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie • Moléculaire?

  3. Les difficultés d’interprétation de la charge virale • Intérêts et limites du séquençage moléculaire

  4. Y Y Y Y Y Y Y Y Y a t-il du nouveau en Sérologie (1) ? L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH et à VHC ? Sérum Patient Y E E E Y Y Ag Ac

  5. L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH • - 5 000 primo-infection / an / France ? . • - 50 % symptomatiques. • Intérêt du dépistage des primo-infection. • .pour l’individu infecté : • traitement de la primo-infection symptomatique ? • 30%- 50% des infections découvertes au stade SIDA • .pour ses partenaires : • transmission très fréquentes à partir de patients en primo-infection

  6. ARN Ag p24 11-12 14-15 20-21 28-29 ARN Fenêtres virologiques Ag P24 Fenêtre sérologiques Sérologie 3° G (Ac) Test sérologiques combinés (Ac +Ag) Raccourcissement de la fenêtre sérologique L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH Ac jours J 0

  7. L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH - Nouveaux Test combinés Ag- Ac ( les plus récents) : • - gain moyen en jours /test Ac lors d’une séroconversion = 5 jours • sensibilité détection Ag variable mais se rapprochant de parfois • des test Ag P24 (5 à 20 pg/ml ) • quelques cas de résultats douteux avec 3 génération + • Suspicion de PI VIH avec 4e génération négatif ou douteux : • toujours faire Ag P24 ou ARN Kwon JA J Virol Method 2005 Ly TD J Virol Method 2004

  8. Sérologie combinée Ag + Ac dans l’infection VHC - Alternative au DGV dans pays en développement ? - Panels de séroconversions VHC .délai moyen apparition Ac = 66 jours Ag- Ac délai moyen = 40 jours ARN = 35 jours . Spécificité test Ag-AC 99.8% 5 jours (0-24) - Intérêt en France ? : - transfusion sur les 2.5 millions de dons en France 2 cas de contamination prévenus par DGV 1 cas de contamination prévenu par Ag-Ac - suivi hémodalysé ? - suivi sujet à risque de primo-infection (épidémie chez homosexuel VIH +) Laperche S , Transfusion 2005

  9. Y a t-il du nouveau en Sérologie (2) ? Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?

  10. Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ? - Séroprévalence HSV2 : . USA: + 30 % dans la population générale (1980-1990) . France étude herpimax : HSV2 +: 17.9% femmes 13.5 % hommes . 100 patients HSV2 .20 « diagnostiqués » .60 symptomatiqués et non diagnostiqués . 20 asymptomatique . La majorité des transmission HSV2 à partir d’une excrétion asymptomatique - des herpes génitaux HSV1 dans les pays occidentaux : . 30% - 50% des premiers épisodes? Malkin JE, 2002

  11. Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ? herpes génital (HSV2) et VIH: - Patient HSV2 + VIH- Augmentation X2 du risque d’être contaminé par HIV - Patient HSV2+VIH+ Probable augmentation du risque de transmettre VIH herpes génital et herpes néonataux - USA Seattle 1 in 3,200 - Netherlands National 1 in 35,000

  12. glycoprotéines très différentes ex / gG1 et gG2 Tests spécifiques de types Sensibilité HSV2 80 à 98% (délai de séroconver. 20-60 jours) Spécificité HSV2 95 % Wald A, Clin Infect Dis2002 Aslley -Morrow R,Sex Transm Dis 2003 Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ? HSV1 et HSV2 85 % identité en aa Glycoprotéine très semblables : ex : gD Tests non spécifiques

  13. Doctor test Anticorps HSV2 : POCkit  HSV2

  14. Sérologies spécifiques de types : l ’immunoblot 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 IgG cont. gD gG2 gG2 gG1 gB1 pep IgG cont. Non typable HSV-1 HSV-2 1 +2

  15. Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ? . Intérêts épidémiologiques : oui .IVS va lancer une nouvelle enquête de séroprévalence HSV 2 . Intérêts individuels : très discuté Couple avec un partenaire porteur de l’herpes génital ? Femme enceinte ? Sujet à multipartenariat sexuel (CDAG) …. problème du HSV1 génital et de la méconnaissance de l’herpes génital dans le milieu médical

  16. Y a t-il du nouveau en Sérologie (3) ? Les sérologies pour dater l’infection VIH : Test spécifiques pour diagnostiquer une infection < 6 mois sang sur buvard et quantification des Ac anti enveloppe (V3,gp41) Sensibilité 88% Spécificité 98% Ex Mars –Septembre 2003 : Découvertes séro + % d’infections récentes < 6mois Homosexuel masc. 111 58 % Héterosex 156 32 % Lot F, Eurosurveillance 2004 Barin F, J Clin Microbiol 2005

  17. Femme Enceinte Sero + : 50 % Femme Enceinte Sero - : 50 % Réactivation Primo-infec Fréquence 10-30 % 1- 4% transmission 0.2- 2 % 35- 50% fœtus sympto excep 10 % Mortalité excep 10 % Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG : .L’avidité des IgG pour l’antigène augmente avec le temps : une avidité élevée est en faveur d’une infection ancienne . Infection à CMV chez la femme enceinte : CMV: 1ere cause d ’infection congénitale (0,4 à 2,3%) en France

  18. Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG : chez la femme enceinte face à des IgM anti-CMV avec ou sans signe clinique de primo-infection : avidité < 20% primo-infection ds les deux mois précédent > 70 % infection datant de plus de 3 mois . à ne pas mettre entre toute les mains . à utiliser avec les autres stratégies pour dater l’infection . sérums antérieurs . culture ou PCR dans les urines . Si doute Liquide amniotique

  19. Evolution des anticorps anti-CMV avec le temps : IgG IgM IgG IgM Persistance prolongée des IgM Avidité des IgG IgG IgM IgM Réactivation

  20. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? Exemple 1 : infection respiratoires basses : 148 LBA (2001-2002) (chez 111 adultes dont 78 % immunodéprimé ,113 LBA sous ATB ) Groupe 1 Suspicion d’infections respiratoires basses n= 117 Groupe 2 Absence d’infection n= 31 Sub-groupe 1 Transplantés pulmonaires n= 31 Sub-groupe 2 Transplantés pulmonaires n= 26 4 types de Cultures cellulaires 11 RT PCRs Qualitatives Garbino J, Am J Respi Crit Care Med, 2004

  21. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? Groupe 1 n= 117 34 virus respiratoires (29%) Groupe 2 n= 31 2 virus respiratoires (7%) P<0.01 • Mortalité à J 30 ds groupe 1 : • Virus + = 10% • Virus - = 14% P=0.49 - PCR positive 3 fois plus souvent que la culture ( p< 0.001) - 45 % des infections virales : printemps- été - Virus le plus fréquent dans le LBA : rhinovirus > VRS Garbino J,2004

  22. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? Sub Groupe 1 Transplantés : 17 /31 = 55% Sub Groupe 2 Transplantés : 1/26= 4% P <0.001 Rhinovirus 9 RSV 4 Influenza A /B 2 Parainfluenza 1 Adenovirus 1 Rhinovirus 1 pas de métapneumovirus ni de coronavirus Virus présent uniquement au moment des symptômes CMV 4 CMV 4 Co- infect. bact/fung 5 (16%) versus 6 (23%) Garbino J 2004

  23. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? Sub Groupe 1 Transplantés : 17 /31 = 55% Sub Groupe 2 Transplantés : 1/26= 4% P <0.001 Pas de différence de survie à J30 selon la présence ou non de virus dans le LBA LBA virus + = 89 % LBA virus - = 100 % Garbino J 2004

  24. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? • 72 greffés médullaires adultes ( 75 % allogreffe)(Oct. 99-Avril 2001) • . prélèvement nasal et gorge systématique J0 S3 S8 S16 S26 • . prélèvement si suspicion infection respiratoire : • - nez-gorge si infection haute • - LBA si besoin dans infection basse • . Culture et PCR . 41 infections respiratoires hautes et 11 infections basses (9LBA) . Inf. hautes : 25 PCR + (61%) vs 10 Culture + ( 24%) ( p< .0001) . Inf. basses : 8 PCR + (73%) vs 1 culture + ( 9%) ( p= .008) Van Kraaij M, Clin Infect, Dis 2005

  25. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? • Virologie moléculaire et infections respiratoires basses : • 3 fois plus de prélèvements positifs pour les Virus respiratoires • mise en évidence de nouveaux virus • . métapneumo, coronaV, boccaV. • (. Ou de virus respiratoires haut dans les LBA) • Rôle en terme de mortalité et morbidité pas toujours évident • Peu d’antiviraux

  26. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? Exemple 2 : l’herpes génital tout venant: 334 prélèvements de patients (HSV2 séro+) avec lésions suspectes d’herpes génital : PCR HSV 2 Pos Neg Pos 157 5 Cult. Neg 104 68 Cult. + : 10 4 copies (101 à10 6 ) Cult. - : 10 1 copies (101 à10 4 ) Ryncarz AJ, J Clin Microbiol 1999

  27. Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire? -Exemple 2 : l’herpes génital femme enceinte . 100 femmes enceintes asymtomatique à l ’accouchement: . 0 culture positive (littérature 0.05 à 2.3%) . 9 PCR positives . Aucun herpès néonatal . 2 femmes asympto. avec culture négative et herpès néonatal . 2 PCR + (avec une CV élevée) Que faire devant une culture- PCR+ ? Cone RW, JAMA 1994

  28. Cas clinique Femme enceinte sur le point d ’accoucher dans une clinique privée : - Lésions grande lèvre droite. Premier épisode - Antigène : + avec neutralisation douteuse: faux + ? - PCR le même jour : HSV + Césarienne Culture positive le lendemain HSV2

  29. Les difficultés de l’interprétation des charges virales Exemple 1 : les charges virales faibles chez le VIH - BLIPs : épisodes transitoires de 50 < CV< 1000 copies/ml chez des patients compliants : .Fréquence ? 30 % lors d’un suivi tous les 3mois ? . Pas prédictif d’un échec virologique . n’entraînent pas l’apparition de mutants résistants ? Nettles Re, JAMA 2005 Sungkanuparph S, Clin Infect Dis 2005 Macias J, J Infect , 2005 • Virémie persistantes > 400 -10000 • . apparition résistances • . évolution clinique à terme

  30. Les difficultés de l’interprétation des charges virales Exemple 2 Charge virale VHC en fin de traitement : 208 patients ARN VHC – par technique conventionnelle (50 UI/mL) à la fin du Tt Peg IFN +Riba TMA (10UI/mL) 26 ARN + 182 ARN - 22 rechutes (96%) 26 rechutes (14%) P<0.0001 Gerotto J hepatol 2006

  31. Les difficultés de l’interprétation des charges virales Exemple 3 : valeur prédictive de la Charge virale EBV pour la prise en charge des syndrome lymphoprolifératifs post transplantation SLPT

  32. Slifkin M, Drugs 2004

  33. Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ? 37 % 0 % 100 % 80 % 80 % 100 % 5 4,5 4 3,5 3 EBV copies /µg DNA or /mL serum (log10) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 PBMCSERUM PBMC SERUM SERUM PBMC healthy IM NPCPTLD a (n=32) (n=17) (n=10) (n=5) Brengel-Pesce, J Med virol 2002

  34. EBV load (copies/µg ADN) 16,000 anti-CD20 14,000 12,000 10,000 8,000 6,000 tonsillectomy 4,000 2,000 07/99 09/99 11/99 01/00 03/00 05/00 localized PTLD systemic PTLD Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ? Brengel Pesce J Med Virol, 2002

  35. Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ? Etude Gärtner et al (2002) Cut-off 10 000 Méthode Quantitative PCR (copies/µg ADN) Sensibilité 87% Spécificité 91% Grenoble PCR en temps réel : CV élevée > 10 000 copies / ml CV tres élevée > 100 000 copies/ml Variation significative 1log

  36. Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ? - intérêt d’une cinétique hebdomadaire les 3 premiers mois pour les greffes à haut risque ( R-/D+, IS+++) : Augmentation rapide de la charge virale = prédictive -possibilité de charge virale élevée sans maladie seulement 50 % des CV élevé font un SLPT ?(Wagner Blood 2004). Charge virale haute : à interpréter avec précaution en tenant compte des autres facteurs de risque de SLPT - possibilité de charge virale faible dans maladie localisée - possibilité d’absence de rémission malgré évolution favorable de la cv ? - intérêt de la mesure des CTL anti EBV ?

  37. Les difficultés de l’interprétation des charges virales Exemple 3 la MEH Plutôt oui : .16 patients - réaugmentation chez un patients traité décès - >100 copies / ml mauvais pronostic ? Domingues, J Clin Microbiol 1998 . 27 enfants avec réponse au TT - 7 rechutes - 2 / 7 réapparition secondaire de l ’ADN HSV Ito; Clin Infect Dis 2000 Plutôt non : - 26 patients MEH (98 LCR) - diminution CV sous traitement - pas de corrélation avec gravité Revello , Clin Diagn Virol 1997

  38. Les difficultés de l’interprétation des charges virales Exemple 4 : Faut-il mesurer autres choses en plus des charges virales . VIH et ADN Proviral .322 patients de la cohorte Séroco suivi 8 ans (1988-1996) .dans les 6 mois qui suivent la séroconversion, l’ADN est plus prédictif de la progression de la maladie que l’ARN ou les CD4 .ensuite ( 6-24mois) facteur prédictif indépendant de ARN ou CD4 Rouzioux C, J Infect Ds 2005 . ARN Messager du cycle lytique et herpes virus ? . + Prédictif d’une maladie virale ?

  39. Intérêts et limites des génotypages viraux

  40. Intérêts et limites des génotypages viraux « pré thérapeutiques » En routine Genotypage VHC Genotypage Papilloma Intérêt pour les autres virus ? Génotypage VHB Soustypage VIH

  41. Intérêts et limites des génotypages des résistances par séquençage moléculaire • Exemple Génotypage VIH • intérêt certains en cas d’échec virologique et dans les primo-infec • et probable en début de traitement • - interprétation spécialisée • - les questions en suspend : • . sensibilité suffisante du séquençage ? • . différences d’interprétation selon les algorithmes • . intérêt de l’association avec critères pharmacologiques • . corrélation phénotype –génotype

  42. Conclusions : La sérologie a un avenir : indispensable en épidémiologie intéressante dans des cas individuels difficile à condition d’avoir des bons sérologistes La biologie moléculaire va remplacer la culture virale (et la détection d’Ag) en routine garder un petit nombre de centre de référence pour collectionner les souches l’ amélioration de la sensiblité pose des pb d’interprétations médicale les VPP pour les maladies à Herpes virus chez le transplantés sont difficile à établir le génotypage des résistances nécessite une expertise

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